PPARγ低表達對AngⅡ誘導H9c2心肌細胞肥大的影響

賴玲 繆林煜 廖偉

(1贛州市人民醫院,江西 贛州 341000;2贛南醫科大學)

心血管疾病是全球發病率和死亡率的主要因素,也是許多慢性病的共同終點,而心肌肥厚是心力衰竭的一個主要病因。心肌肥厚有生理性和病理性兩種類型。心肌肥大最初發展為對生理和病理刺激的適應性反應,但病理性心肌肥大通常進展為心力衰竭。每種形式的肥大都受到不同細胞信號通路的調節。目前,心肌細胞肥大(MCR)調控機制有脂肪代謝、膠原蛋白合成、增殖信號通路、轉錄因子。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ是過氧化物酶體增殖物配體激活后調節基因表達的轉錄因子之一。PPAR是心臟的生理主開關,指導心肌細胞的心臟能量代謝,從而影響心力衰竭、心肌肥厚。本研究旨在探討PPARγ低表達對血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的H9c2 MCR的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑 大鼠心肌細胞株H9c2購自中國科學院細胞庫;AD-PPARγRNAi腺病毒購于上海吉凱基因;PPARγ、肌球蛋白重鏈(MYH)7B、心鈉肽(ANP)抗體購于Abcam 公司;抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)、抗兔IgG-HRP二抗購自Abclonal公司;β-actin 小鼠單克隆抗體購自中山金橋公司;AngⅡ購自Abcam 公司;胎牛血清購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司;DMEM、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、RIPA 裂解液購自索萊寶公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天;超敏化學發光試劑盒購自Thermo公司。

1.2細胞培養 用含10%胎牛血清的DMEM 培養液培養細胞,隔天換液1次,待細胞長至約占培養皿90%時,用PBS 沖洗2遍,加數滴25%胰酶,消化1～2 min,加含血清培養液終止消化,用槍頭輕輕吹打使細胞脫落,離心、重懸后按1∶3比例接種到新的培養皿中。

1.3構建MCR模型 把需要用的實驗材料及試劑放于細胞房無菌超凈臺桌面上打開紫外燈,消毒30 min。在超凈工作臺將舊培養基倒入廢棄桶,PBS洗滌2次,然后用移液管吸干剩余的培養溶液。最后加入新配濃度為10-7mol/L的AngⅡ培養基,做好標記,繼續放入孵箱培養至48 h。

1.4細胞分組 采用AD-PPARγRNAi重組腺病毒載體,感染到H9c2心肌細胞中。最終分為對照組、Vehicle組、AD-PPARγRNAi組;MCR組、MCR+Vehicle組、MCR+AD-PPARγRNAi組6組。

1.5AD-PPARγRNAi感染H9c2細胞 在病毒房細胞超凈臺內,準備好細胞換液的實驗用品,打開紫外線照射30 min,同時打開病毒房紫外線照射30 min。將細胞板中的液體倒入臺面上的廢棄桶,同時加入5 ml PBS,稍微搖晃幾下,將液體倒入臺面上的廢棄桶,PBS洗滌2次。將計劃好的病毒液體與培養液混勻后分別加入到Vehicle組、AD-PPARγRNAi組、MCR+Vehicle組、MCR+AD-PPARγRNAi組的細胞板內,做好標記,放置孵箱最底層,培養2 h后,再次增加5 ml培養液。培養12 h后,將含病毒液培養的 H9c2細胞從孵箱中取出,將細胞在病毒室的潔凈室中更換,并繼續在培養箱中放置48 h。

1.6H9c2細胞蘇木素-伊紅(HE)染色 (1)細胞狀態達90%左右時可進行HE染色。6組均需要PBS洗滌2次;取出儲存在4 ℃冰箱中的4%多聚甲醛,均勻加入細胞中固定10 min。PBS洗滌3～5次,將移液槍吸取殘留余PBS并干燥,均勻加入蘇木素染液浸染8 min,分別加入二蒸水浸洗數遍,控干水分。加入分化液分色數秒,再藍化H9c2細胞的核通過用準備好的涼水(100 ℃水放涼后)。用移液管吸取伊紅染液在細胞板內,5 min,在水龍頭下直接沖洗。最后脫色透明后在鏡下觀察拍照,每組重復3次。

1.7Western印跡法檢測蛋白表達

1.7.1細胞蛋白提取 (1)配制細胞裂解液:計算好需要的量并預先冷卻RIPA 裂解液,PMSF按100∶1比例準備,將其放在渦流振蕩器上并充分混合,放在冰上或保存在4 ℃的冰箱中。(2)將細胞板中的液體倒入廢棄桶,同時加入5 ml PBS,稍微搖晃幾下,將液體倒入廢棄桶,重復再洗1次后,分別用大、中、小移液槍反復將剩余液體吸干凈,盡量去除剩余液體。(3)用移液槍吸取300～400 μl預冷后的細胞裂解液均勻滴加在培養皿中,放入4 ℃冰箱或冰上,5 min后輕輕搖晃使裂解液盡量覆蓋細胞上,繼續裂解5 min。(4)首先把細胞板放在冰上,接著用消毒后的細胞刮在細胞板上將H9c2細胞全部刮下至細胞板面光滑為止,最后將液體轉入離心管內。(5)將含有細胞液的離心管用透明薄膜密封,置于4 ℃離心機中,以12 000 r/min離心15 min,最后保留上清液用于標記。(6)再將含蛋白質且標記好的EP管封口處理后存放在-20 ℃冰箱,不要反復凍融。

1.7.2蛋白濃度測定 (1)配制工作液:計算好需要的工作液,按混合試劑A與試劑B為50∶1比例配制,放于旋渦振蕩器上充分混勻后,將其放置冰上或4 ℃冰箱保存待用。(2)從-20 ℃冰箱內取出BSA標準液室溫下溶解,配制標準品蛋白溶液:吸取20 μl BSA至EP管,再加入30 μl ddH2O,混勻,從中取出25 μl連續倍比稀釋,標準濃度為:0、25、50、100、200、400、800、1 600 μg/ml,在96孔板中向每個孔中加入25 μl。(3)待測樣品處理:取每組樣品用三蒸水分別稀釋成0、1、5、10、20倍,依次加入25 μl至96孔板中。(4)將配好的BCA工作液分別加入200 μl至標準蛋白液孔中及待測樣品空中,輕柔混勻,放于37 ℃恒溫箱,30 min。(5)提前打開酶標儀,預熱。將96孔板放置在酶標儀的指定位置,設置A562 nm的波長,運行程序,記錄光密度(OD)值,并根據每個孔測量的數據獲得標準曲線,從而計算樣品上樣量。

1.7.3電泳分離 (1)洗干凈配膠板同時用ddH2O沖洗,并固定在配膠固定架上,用橡膠板注入ddH2O泄漏檢測5 min,并去除板表面之間的 ddH2O備用。(2)接著按照表1分別配制12%、10%、8%的分離膠。(3)放在振蕩器上混勻后,用大移液槍迅速將液體加入玻璃板間隙內,操作過程中注意不要產生氣泡,接著加入1.5 ml異丙醇排除氣泡在室溫下放置50 min,倒掉異丙醇同時用ddH2O洗干凈,并用濾紙吸干凈。(4)配制5%聚成膠:其中ddH2O 3.4 ml,30% Acr-Bic 0.83 ml,Tris.HCl(pH6.8),0.63 ml 10%SDS 0.05 ml,10%AP 0.05 ml,TEMED 0.005 ml。(5)放在振蕩器上混勻后,用大移液槍迅速將液體加入玻璃板間隙內操作過程中注意不要產生氣泡,同時將晾干的梳子快速的插入,室溫條件下放置45 min左右。(6)上樣:根據BCA法蛋白定量結果及實驗分組調整進樣量以使每個泳道蛋白上樣量一致。用進樣針吸取相應體積的蛋白緩慢注入泳道內,并在兩側分別注入3～5 μl蛋白Marker。(7)電泳槽被固定好后,并注入現配好的1倍電泳緩沖液,插好電泳儀電源,設置90 V恒壓30 min條件,當溴酚藍到達分離層時,將其調到120 V恒壓,且電泳持續60 min至溴酚藍到底部。

表1 分離膠配制

1.7.4蛋白的膜轉移、顯色、檢測 (1)濕轉:從電泳槽中取出膠板,按蛋白分子量大小,參照蛋白分子 marker,用刀片切下相應的膠塊,浸泡在預冷的1倍濕轉緩沖液中,將聚偏氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中電離1 min,制備膜夾。按照“黑膠白膜”的原則放入切好的膠塊及 PVDF膜,排盡膜與膠之間的氣體,堵住濕轉移夾,蓋住電轉移裝置,調好濕轉移條件,四周放入冰水及冰袋。(2)封閉:從濕轉移裝置中取出PVDF膜,輕輕沖洗TTBS并置于現成的5%脫脂乳中,在室溫下封閉2 h。(3)一抗孵育:從封閉溶液中取出PVDF膜,輕輕沖洗TTBS以除去殘留的封閉溶液,然后置于相應的一抗中,并在4 ℃溫育過夜。(4)二抗孵育:第2天,取出PVDF膜,漂洗TIBS 10 min×4(根據暴露背景適當調整特定的漂洗時間),根據初級來源選擇二級抗體。(5)曝光:二抗中取出PVDF膜后,TTBS漂洗10 min×5(具體漂洗時間根據曝光背景做出適當調整),吸干PVDF膜上殘留TBS,將ECL試劑盒中A與B溶液以1∶1比列混勻后,把PVDF膜放在混合液中,最后曝光成像同時保存圖片。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1H9c2細胞模型的構建 HE染色結果顯示,MCR組與對照組比較,H9c2細胞核形態大小變大,見圖1。Western 印跡結果顯示:與對照組比較,MCR組MYH7B、ANP的表達顯著增加(P<0.05),表明MCR模型構建成功。見圖2、表2。

圖1 HE染色H9c2細胞(×200)

1～6:對照組、Vehicle組、AD-PPARγRNA組、MCR組、MCR+Vehicle組、MCR+AD-PPARγRNAi組

表2 AD-PPARγRNAi感染H9c2細胞PPARγ、MYH7B、ANP的相對表達量

2.2各組PPARγ低表達比較 AD-PPARγRNAi組較對照組和Vehicle組PPARγ表達明顯降低(P<0.05);MCR+AD-PPARγRNAi組較MCR和MCR+Vehicle組明顯降低(P<0.05),見表2。

2.3空白對照與病毒對照比較 HE染色結果顯示,Vehicle組較對照組H9c2細胞核形態大小無明顯變化,MCR+Vehicle組與MCR組比較H9c2細胞核形態大小無明顯變化;Vehicle組與對照組比較、MCR+Vehicle組與MCR組比較PPARγ、MYH7B、ANP表達均無明顯差異(P>0.05),見圖1、圖2、表2。

2.4AD-PPARγRNAi感染H9c2細胞MYH7B、ANP的相對表達情況比較 Western印跡條帶分析顯示,與對照組比較,AD-PPARγRNAi組MYH7B、ANP表達明顯增加(P<0.05);與MCR組比較,MCR+AD-PPARγRNAi組MYH7B、ANP表達明顯增加(P<0.05),見表2。

3 討 論

心肌肥厚是導致心力衰竭的一個重要病因,也會導致心臟疾病患者死亡。病理性心肌肥大除了細胞生長和蛋白質合成外,心肌肥大會變成適應不良的失代償:細胞死亡、纖維化、Ca2+處理蛋白失調、線粒體功能障礙、代謝重塑、胎兒基因表達重新激活、蛋白質和線粒體調控受損、肌節結構改變和血管生成不足。誘導這些反應的信號機制促進了適應不良的心臟重塑和功能障礙,并最終導致心力衰竭。因此,伴隨上述反應的心肌肥大通常被認為是病理性的。抑制心肌肥大的信號通路在治療上可能存在重要作用。高血壓和心肌梗死等病理狀況主要通過神經內分泌激素和機械力促進病理性肥大,并伴有與生理性肥大不同的信號通路。

心臟代謝在生理和病理性心肌肥大中受到不同調節〔1〕。全身及心臟代謝的變化在心力衰竭發展之前〔2,3〕。心肌肥大反應過程中能量代謝的適應受損加劇病理性心肌肥大,增加心肌細胞死亡。ATP產生的過程直接改變收縮功能并導致心力衰竭〔4,5〕。在心肌肥大過程中,雌激素受體相關受體(ERR)α與過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子(PGC)1α相互作用,通過增加編碼參與三羧酸(TCA)循環的蛋白質基因表達來激活線粒體能量代謝和氧化磷酸化。盡管編碼ERRα的基因缺失不會影響TAC誘導心肌肥大的最初發展,但ERRα缺乏會促進向心力衰竭的轉變〔6〕。編碼清道夫受體基因的心臟特異性CD36缺失,將減少心臟中脂肪酸的攝取和利用,加劇壓力超負荷引起的心功能不全和心力衰竭,但不影響心肌肥大程度〔7〕。以上表明適當的代謝作用將適應病理性心肌肥大維持收縮功能。編碼胰島素受體基因的心臟特異性缺失通過損害脂肪酸和丙酮酸代謝及 TCA 來促進線粒體功能障礙、氧化應激和收縮功能障礙〔8〕。因此,誘導生理性心肌肥大的信號機制可能協調線粒體的代謝來維持心臟功能。改變的代謝物也會促進病理性心肌肥大或心力衰竭。基因工程小鼠模型中脂肪酸或碳水化合物代謝失調直接誘導心肌肥大或通過調節病理性心肌肥大的信號機制導致功能下降〔9～14〕。

PPAR是一類配體激活的核轉錄因子在脂質和脂蛋白代謝、葡萄糖平衡中的作用代謝、細胞增殖、分化和凋亡中發揮重要作用。根據專業結構,PPARs可分為3個亞組:PPARα〔也稱為核受體亞家族 1 組 C 成員(NR1C)1〕、PPARδ(也稱為 PPARβ 或 NR1C2)和 PPARγ(也稱為 NR1C3)。最初發現,PPARγ主要是在脂肪細胞中調節脂肪細胞的分化而脂質代謝和提高胰島素敏感性,故與高血壓、肥胖、動脈粥樣硬化、Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗密切相關。最近發現,PPARγ也在心臟、血管平滑肌細胞、內皮細胞等部位中表達。此外,PPARγ激活劑吡格列酮和羅格列酮可抑制AngⅡ誘導的新生大鼠MCR。表明PPARγ參與了MCR的病理生理過程。

本研究通過高糖培養基結合AngⅡ培養H9c2 心肌細胞48 h MYH7B、ANP表達增加,再給予AD-PPARγRNAi重組腺病毒感染后MYH7B、ANP表達上調。

綜上,保護心肌細胞中PPARγ至關重要,后續研究繼續探討PPARγ高表達是否對改善或逆轉MCR有重要作用,本研究為了解心肌肥厚機制、心肌細胞的防治策略及以PPARγ為靶點新藥開發提供依據。