桑白皮多糖介導(dǎo)Nrf2/ARE通路減輕慢性低氧環(huán)境大鼠心肌損傷的作用

王曉磊 黃輝 陳昕芳 李紅

(昆山市中醫(yī)醫(yī)院肺病科,江蘇 昆山 215300)

心肌低氧是人體功能紊亂的常見問題之一,臨床上如心肌梗死、心絞痛及高原環(huán)境下均長期處于慢性低氧狀態(tài),而長期處于低氧環(huán)境會加重心肌損傷,嚴(yán)重?fù)p害心功能〔1〕。目前臨床上對于低氧引起心臟疾病的治療主要為氧療和激素治療,雖具有一定緩解作用,但仍對多個組織器官造成不可逆轉(zhuǎn)的損害〔2〕,因而探索高效的藥物對于預(yù)防和減輕低氧造成的心肌損傷具有重要意義。桑白皮多糖提取自桑白皮,已有研究報道桑白皮多糖對心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,推測與抗氧化應(yīng)激有關(guān)〔3〕。心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)在低氧誘發(fā)的心肌損傷過程中發(fā)揮重要作用〔4〕。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf)2/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)是參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵,在心血管系統(tǒng)廣泛分布,研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控Nrf2/ARE通路,可調(diào)控心肌組織的氧化應(yīng)激反應(yīng),發(fā)揮對低氧誘發(fā)心肌損傷的保護(hù)作用〔5〕。然而桑白皮多糖能否通過介導(dǎo)Nrf2/ARE通路調(diào)控慢性低氧環(huán)境誘導(dǎo)的心肌損傷尚未可知。鑒于此,本研究選取SD大鼠進(jìn)行動物學(xué)實驗,研究桑白皮多糖通過介導(dǎo)Nrf2/ARE通路調(diào)控慢性低氧環(huán)境中心肌損傷的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只成年SD大鼠(30只雄性、30只雌性),7～9周齡,清潔級,體質(zhì)量200～250 g,武漢大學(xué)動物實驗中心〔SCXK(鄂)2019-0004〕。

1.2實驗藥品與試劑 蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶,批號G1120-3);桑白皮多糖(上海益本,批號sbp);阿托伐他汀(江西瑞威爾,批號134523-00-5);血漿肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(上海名勁,批號B7322、B6475、B5503);大鼠丙二醛(MDA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海滬震,批號hz-E12532);原位末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天,批號C1098);總核糖核酸(RNA)提取試劑盒〔天根生化科技,批號DP431〕;Nrf2、血紅素加氧酶(HO)-1、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸脫氫酶(GAPDH)引物(上海雅吉合成);總蛋白提取試劑盒(上海雅吉,批號YD-001);細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(上海梵態(tài),批號FT30504yy);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(南京諾唯贊,批號E112-01);兔抗大鼠Nrf2、p-Nrf2、H3、HO-1、Bcl-2、Bax、GAPDH單克隆抗體,羊抗兔Nrf2、p-Nrf2、H3、HO-1、Bcl-2、Bax、GAPDH辣根過氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體(武漢益普,批號ab137550、A0674、9715、82206、ab73985、2772、2118;32460、A27036、G-21234、31466、A24531、31462、A16116)。

1.3實驗儀器 Gas Blender型常壓低氧艙(上海玉研科學(xué)儀器有限公司);BX46型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯);7500型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國ABI)。

1.4建模、分組及干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字表分6組,各10只。除對照組外構(gòu)建慢性低氧環(huán)境中的心肌損傷模型大鼠〔6〕:腹腔注射4 ml/kg生理鹽水,常壓低氧艙氧濃度為(10±1)%,每天10 h,每周6 d;對照組呼吸室內(nèi)空氣。模型構(gòu)建結(jié)束后24 h,HE染色,常規(guī)固定切片→脫蠟→蘇木素染色→鹽酸乙醇分色→伊紅復(fù)染→脫水→封片→觀察。心肌組織廣泛存在變性壞死病灶,心肌纖維排列紊亂表明建模成功〔7〕。自低氧第1天起,阿托伐他汀組給予20 mg/kg阿托伐他汀腹腔注射給藥,桑白皮多糖低、中、高劑量組分別給予0.1、0.2、0.4 μg/ml桑白皮多糖腹腔注射給藥,對照組和模型組僅予腹腔注射生理鹽水。

1.5HE染色觀察各組心肌組織病變情況 末次給藥后24 h,處死后HE染色觀察各組心肌組織病變情況,步驟同上。

1.6TUNEL檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率 末次給藥后24 h,處死進(jìn)行TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性,測定凋亡率。

1.7血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 末次給藥后24 h,取腹主動脈血5 ml以酶聯(lián)免疫法測定。血樣靜置4 h,3 000 r/min、15 min離心,取上清即為血清;取各組心肌組織100 mg,勻漿機(jī)研磨后3 000 r/min、30 min離心。取上清測定血清CK、LDH和心肌組織SOD活性及MDA水平。

1.8心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax基因表達(dá) 末次給藥后24 h處死,以實時-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測。提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄,充分混勻各體系,然后95 ℃ 5 min→30個循環(huán)(95 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s)→72 ℃ 10 min〔8〕,計算2-ΔΔCt。引物序列:Nrf2上游引物5′-CTTTTGGCGCAGACATTCCC-3′,下游5′-GACTGGGCTCTCGATGTGAC-3′;HO-1上游引物5′-CAGTGCCACCAAGTTCAAGC-3′,下游5′-GTTGAGCAGGAACGCAGTCTT-3′;Bcl-2上游引物5′-GGACAACATCGCCCTGTG-3′,下游5′-AGTCTTCAGACAGACAGCCAGGA-3′;Bax上游引物5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′,下游5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′;GAPDH上游引物5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3′,下游5′-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3′。

1.9Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及p-Nrf2水平 末次給藥后24 h,處死取心肌組織,裂解、提取總蛋白、蛋白定量、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一次加入一抗、二抗,前者4 ℃過夜、后者室溫2 h。顯色、掃描并分析蛋白條帶灰度值,計算相對表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行One way ANOVA分析與SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA和蛋白及p-Nrf2水平比較 與對照組比較,模型組Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)明顯下降,Bax蛋白和mRNA表達(dá)、p-Nrf2、p-Nrf2/Nrf2水平明顯上升(P<0.05);與模型組比較,阿托伐他汀組與桑白皮多糖各劑量組Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)及p-Nrf2、p-Nrf2/Nrf2水平明顯上升,Bax蛋白和mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)。見圖1、表1和表2。

1～6:對照組、模型組、阿托伐他汀組、桑白皮多糖低、中、高劑量組

表1 各組Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)比較

表2 各組Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及p-Nrf2、p-Nrf2/Nrf2水平比較

2.2心肌組織病理觀察 對照組心肌組織正常;模型組心肌嚴(yán)重?fù)p傷,可見廣泛壞死,心肌纖維排列紊亂,縱橫紋不清;阿托伐他汀組和桑白皮多糖低劑量組心肌組織壞死病灶減少,心肌纖維排列紊亂;桑白皮多糖中劑量組心肌組織壞死病灶進(jìn)一步減少,心肌纖維排列更加整齊;桑白皮多糖高劑量組心肌組織趨于正常。見圖2。

圖2 各組心肌組織(HE染色,×400)及心肌細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.3各組心肌細(xì)胞凋亡率比較 與對照組比較,模型組心肌細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05);與模型組比較,阿托伐他汀組和桑白皮多糖各劑量組心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05);桑白皮多糖各劑量組心肌細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性。見圖2、表3。

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率、CK、LDH、心肌組織SOD活性及MDA水平比較

2.4各組CK、LDH、心肌組織SOD活性及MDA水平比較 與對照組比較,模型組CK、LDH活性和MDA水平明顯上升,SOD水平明顯下降(P<0.05);與模型組比較,阿托伐他汀組和桑白皮多糖各劑量組CK、LDH活性和MDA水平明顯下降,SOD水平明顯上升(P<0.05);桑白皮多糖各劑量組CK、LDH活性和MDA水平呈劑量依賴性降低,SOD水平呈劑量依賴性上升。見表3。

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷是低氧環(huán)境中心肌損傷發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理機(jī)制〔9〕。長期處于低氧狀態(tài)所導(dǎo)致的心肌損傷嚴(yán)重影響心臟功能,同時還導(dǎo)致和誘發(fā)諸多其他臟器的病理損傷及衰竭〔10〕,因此尋找高效的藥物至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示,模型組心肌細(xì)胞損傷明顯,心肌組織結(jié)構(gòu)不清,固縮,血漿溶解,與既往研究〔11〕構(gòu)建模型結(jié)果一致,表明本研究成功構(gòu)建慢性低氧性心肌損傷模型。阿托伐他汀可有效抑制心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng),減少心肌細(xì)胞凋亡〔12〕,故選取其為陽性對照,符合實驗原則。本研究中,桑白皮多糖可改善心肌組織損傷的病理情況,抑制心肌細(xì)胞凋亡。低氧引起的心肌損傷常伴隨氧化應(yīng)激反應(yīng)〔13〕,研究指出,桑白皮多糖具有抗氧化功能〔14〕,據(jù)此推測桑白皮多糖可能通過抗氧化功能發(fā)揮對心肌組織的保護(hù)作用。

Nrf2/ARE通路作為抗氧化應(yīng)激的核心通路之一,與心肌損傷的調(diào)節(jié)密切相關(guān)〔15〕;正常生理條件下,Nrf2錨定于胞質(zhì)中,只有極少部分活化的Nrf2入核與ARE識別并結(jié)合,使抗氧化物處于基礎(chǔ)表達(dá)水平,維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài),當(dāng)受到外界如缺氧刺激時,Nrf2迅速被磷酸化激活入核,識別并結(jié)合ARE序列,啟動下游細(xì)胞內(nèi)氧化-還原平衡蛋白基因的表達(dá),從而增強(qiáng)細(xì)胞對于氧化應(yīng)激的耐受性〔16〕。Dang等〔17〕指出,通過增強(qiáng)Nrf2/ARE通路可減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷。HO-1是Nrf2/ARE通路下游重要的靶基因,在細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化過程發(fā)揮重要作用〔18〕。當(dāng)心肌缺氧損傷時會導(dǎo)致心肌酶LDH和CK釋放入血,清除自由基的首要物質(zhì)SOD活性降低,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加〔19〕。Bcl-2發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的功能,Bax發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能,兩者在心肌細(xì)胞損傷中至關(guān)重要〔20〕。劉琳〔21〕指出,通過激活Nrf2/ARE通路,促進(jìn)Nrf2、HO-1、Bcl-2表達(dá),抑制MDA、Bax表達(dá),抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和凋亡,保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧-復(fù)氧損傷;崔玉祥等〔22〕指出,通過激活Nrf2/ARE通路,上調(diào)p-Nrf2/Nrf2水平,下調(diào)心肌酶活性和MDA水平,上調(diào)SOD活性,可保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧復(fù)氧損傷。本研究與上述分析相符,提示桑白皮多糖很可能通過激活Nrf2/ARE通路減輕慢性低氧環(huán)境心肌損傷。

綜上,桑白皮多糖可減輕慢性低氧環(huán)境大鼠心肌損傷,可能通過激活Nrf2/ARE通路,促進(jìn)HO-1、Bcl-2表達(dá),增加SOD活性,下調(diào)CK和LDH活性和MDA水平,抑制Bax表達(dá)保護(hù)心肌組織。另外,桑白皮多糖呈劑量依賴性,在一定劑量范圍內(nèi)可增加該藥物使用劑量以發(fā)揮增效目的。