衣藻對鹽脅迫下小麥幼苗生長和生理指標的影響研究

王彥欽，李武陽，孟憲剛*，羅光宏

(1.蘭州交通大學 生物與制藥工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學院 甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅 張掖 734000)

鹽脅迫現已成為生物所面臨的主要非生物脅迫之一，我國鹽漬化土壤在19個省份均有分布。據報道，中國西北、東北及濱海地區受鹽堿脅迫的土地面積超過3.3×107hm2，其中接近一半尚有農業利用潛力[1]。而且，中國西北土壤荒漠化形勢嚴峻，其中鹽漬化是主要誘發因子。研究表明，鹽脅迫通過滲透脅迫、離子傷害等過程損傷植物，抑制生長[2]。當鹽濃度過高時幼苗生長會受到抑制，主要原因是鹽分過高破壞了細胞質的完整性，導致細胞選擇透過性下降甚至喪失，Na+、Cl-等在細胞內大量積累，降低了K、Ca等元素的含量，細胞內離子平衡失調，引發一系列功能紊亂，從而影響幼苗的生長[3]。此外，在鹽堿地上種植的小麥等作物，由于鹽脅迫下，光合系統和酶系統受到干擾，進而影響產量和質量。

微藻是一類光合利用度高的低等自養生物，分布廣泛，種類繁多，具有固碳、固氮等特性[4]。文獻報道，微藻細胞能分泌多聚陰離子大分子胞外多糖(EPS)黏液層，對Na+有強吸附能力，具有優良的脫鹽效果。徐嘉男[5]利用螺旋藻和紫球藻處理鹽堿土，發現螺旋藻可以使土壤有機質含量增加到19.60 g·kg-1，紫球藻分泌的可溶性多糖能夠吸附土壤中的Na+，使可交換性鈉含量降低0.10 cmol·kg-1，土壤堿化度降低16.30%，土壤pH值降至8.3。Liu等[6]的研究發現，絲藻多糖(GFP)和低分子量絲藻多糖(LGFP)顯著提升了鹽脅迫下水稻種子的活力指數。此外，LGFP提升了鹽脅迫下水稻幼苗清除活性氧的能力和抗氧化酶活性，并通過提升Na+/H+逆向轉運基因的表達水平影響了其根系Na+的轉運。另有研究表明[7]，泡葉藻提取物處理可以使鹽脅迫下擬南芥轉錄組發生顯著改變，調節大量響應脅迫的基因表達，從而提高擬南芥的耐鹽性。以上研究表明，微藻可以改良鹽堿化土壤，微藻中的活性成分可以從生理層面和分子層面改變高等植物的耐鹽能力，因此，微藻生物肥料在鹽脅迫下農作物上有良好運用前景。但是鮮有將藻肥運用到鹽脅迫下植物的報道，此外，直接將活體藻類作為生物肥料的應用研究不多，活藻對鹽脅迫下植物生理特性的影響也不明確。

衣藻是綠藻門衣藻科的單細胞藻類，其產生的孢子具有極強的耐受性，且藻株對環境無污染，對人畜沒有致病性[8]。衣藻具有作為生物肥料的良好潛能，衣藻可以分泌大量海藻糖，這種物質具有優良的滲透調節和脅迫保護的作用[9-10]。另有研究表明，在正常光照下，衣藻不僅可以促進土壤微生物的生長，還能夠將磷礦粉中作物不能吸收的磷轉化為可吸收的磷，從而提高土壤中有效磷的含量，進而增強土壤酶活性，最終達到改善土壤質量以及促進作物生長的效果[11]。除此之外，劉翔等[12]的研究發現，沙角衣藻對重金屬脅迫下的小麥幼苗有一定的保護作用。這表明衣藻有提升土壤肥力和提高植物抗逆性的作用。因此，衣藻作為生物肥料具有良好開發前景，此外，衣藻藻粉對鹽脅迫下植物生理指標的影響鮮見報道。

本實驗采用德巴衣藻(Chlamydomonasdebaryana)藻粉作為生物肥料，將不同濃度的衣藻藻粉添加到高鹽脅迫的小麥幼苗中，測定了小麥生物量、可溶性糖含量及可溶性蛋白含量和離子平衡等生理指標。分析了添加不同濃度的衣藻藻粉對鹽脅迫下小麥生長和生理指標的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥長豐2112購自張掖當地農貿市場。衣藻藻粉由甘肅凱源微藻工程技術中心生產的微藻(德巴衣藻)干燥制成粉狀，按比例利用無菌水配制藻液，與無菌水(CK)對照，進行試驗研究。

1.2 小麥不同處理

首先用20%的過氧化氫對小麥種子表面消毒15 min，然后用無菌水沖洗3次后置于溫度為25 ℃的培養箱內，在黑暗狀態下萌發24 h。待種子發芽后，挑選萌發一致的種子放入清洗滅菌后的沙土盆中，并將其置于25 ℃、12 h/12 h (300 μmol·m-2· s-1光照/黑暗)的培養箱內進行培養。培養期間，向沙土盆內繼續添加清水保持沙土濕潤，用于催發小麥種子。待小麥長至兩心一葉時，對T0～T4處理組連續施加50 mL 150 mmol·L-1NaCl溶液10 d，期間T0(150 mmol·L-1NaCl溶液)處理組每天補加等量無菌水，T1～T4(藻處理組：衣藻濃度為分別0.25、0.5、1.0、2.0 g·L-1)每3 d添加50 mL藻液，T0組同時添加50 mL無菌水。

1.3 指標測定

待所有處理完成后12 d時取樣，先用蒸餾水將樣品小麥沖洗3次，再用濾紙擦干植株表面殘留水分，然后用剪刀使小麥根莖分離，再用直尺測定其根長和莖長。之后用分析天平稱得鮮重，再將樣品材料置于烘箱中120 ℃殺青15 min后轉至80 ℃烘箱烘至恒重，稱得干重，以3株幼苗的平均值表示干重和鮮重，單位為 g。測定下列指標：小麥莖長、根長，采用直尺測量；地上部分、地下部分鮮重并進行根系掃描。

取測定鮮重后健康葉片，稱取0.1 g樣品，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白的含量[13]，采用硫酸蒽酮比色法測定小麥葉片中的可溶性糖含量[14]。

采集處理完成后3、6、9、12 d的健康小麥葉片，稱重0.1 g后在-80 ℃冰箱保存。采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)活性以氮藍四唑法測定，過氧化物酶 (POD)活性以愈創木酚法測定，過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用可見光法[15]，上述參數采用DR 600 紫外分光光度計測定。

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel 2013進行整理，用SPSS 21.0軟件進行方差分析，用OriginPro 8.5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 藻粉對鹽脅迫下小麥生長指標的影響

2.1.1 藻粉處理對鹽脅迫下小麥根長和莖長的影響

小麥幼苗經過鹽脅迫后，T0組小麥莖長和根長有了明顯的下降，與CK相比分別下降了29%和60%。和T0相比，T1的根長莖長沒有顯著性差異。而T2～T4處理組效果明顯，與T0相比，其莖長分別增加了44.4%、34.7%、37.1%，根長增加了84.0%、53.6%、52.6%。在鹽脅迫下，施加藻粉對小麥地下部的促進比地上部更加明顯(圖1)。

圖1 藻粉對鹽脅迫下小麥根長和莖長的影響Fig.1 Effects of algae powder on root and stem length of wheat under salt stress

2.1.2 藻粉對鹽脅迫下小麥根和莖干重、鮮重的影響

由圖2、圖3可見，不同濃度藻粉處理對鹽脅迫條件下小麥干重具有明顯的影響。其中，T0處理組莖干重和根干重相比于對照組分別下降了46%和61%。在添加藻粉后，T1處理組莖干重未見明顯變化，但根干重相比于T0處理組增加了61%，T2～T4處理組相比于T0處理組莖干重和根干重均有明顯上升，其中莖干重分別增加了17%、17%、11.1%，根干重增加了112%、81%、132%。藻粉處理對小麥地下部的促進作用更為明顯。鮮重測量亦發現，各處理組與對照組相比，鮮重皆有明顯下降，其中，T0與對照相比其莖鮮重和根鮮重分別下降了54.2%和19.4%，而添加藻粉處理各組，其莖鮮重和根鮮重相比于T0處理組，都有不同程度的提高，其中T2～T4增長較為明顯，各處理組莖鮮重與T0處理組相比，分別增加了29.9%、58.8%、53.6%，根鮮重分別增加了69.7%，60.6%，121.2%。由此可見，在鹽脅迫下，藻粉處理對小麥地下部鮮重的促進較地上部更為明顯。

圖2 藻粉對鹽脅迫下小麥干重的影響Fig.2 Effect of algae powder on dry weight of wheat under salt stress

圖3 藻粉對鹽脅迫下小麥鮮重的影響Fig.3 Effect of algae powder on fresh weight of wheat under salt stress

2.1.3 藻粉處理對鹽脅迫下小麥根系生長的影響

對不同濃度藻粉處理下的鹽脅迫小麥根系掃描結果如圖4所示。

圖4 小麥根系掃描照片Fig.4 Scanning photos of wheat roots

由表1可見，在經過鹽脅迫后，T0根部的各項指標都有不同程度的顯著下降，其中根表面積分枝數、分叉數下降較為明顯，在添加藻粉處理后，各處理組小麥根部的生長狀態得到明顯好轉。

表1 小麥根系掃描數據Table 1 Scanning data of wheat roots

2.2 藻粉處理對鹽脅迫下小麥可溶性蛋白及可溶性糖含量的影響

可溶性蛋白是植物體內用于調節滲透脅迫的重要物質之一。本實驗發現，在經過鹽脅迫12 d，藻粉處理9 d后，小麥葉片內各處理組可溶性蛋白的含量有了明顯的下降，其中T0處理組最為顯著，相比于對照組CK下降了38.5%，而經過添加不同濃度的藻粉處理后，各處理組(T1、T2、T3、T4)可溶性蛋白的含量分別比鹽脅迫處理組T0提高了14.7%、15.2%、46.2%和18.1%，其中以T3處理組最為顯著，而T1和T4處理組無顯著性差異(圖5)。由此說明，用一定濃度的藻粉處理能有效地緩解鹽脅迫帶來的葉片中可溶性蛋白含量的下降。

同組柱上無相同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。圖6同。圖5 藻粉對鹽脅迫下小麥可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of algae powder on soluble protein content of wheat under salt stress

可溶性糖也是植物體內重要的滲透調節物質之一，其含量的變化能直觀地反映出植物受到鹽脅迫后體內的滲透調節過程。本實驗發現，小麥鹽脅迫處理12 d，藻粉處理9 d后，小麥葉片中可溶性糖含量如圖6所示。

圖6 藻粉對鹽脅迫下小麥可溶性糖含量的影響Fig.6 Effect of algae powder on soluble sugar content of wheat under salt stress

由圖6可見，在鹽脅迫條件下，各處理組可溶性糖含量都有了明顯的下降，其中鹽脅迫處理組T0相比于對照組，其可溶性糖含量大幅下降了62.6%，而經過不同濃度的藻粉處理后，各處理組(T1、T2、T3、T4)與T0相比可溶性糖的含量都有了不同程度的提高，分別提高了28.5%、89.1%、100.5%、109.1%，各處理組提升的比例也有顯著性差異，其中T1處理組可溶性糖含量的提升水平顯著低于T2、T3和T4處理組，說明高濃度的藻粉處理對小麥葉片可溶性糖含量的提升要高于低濃度藻粉處理。

2.3 藻粉處理對鹽脅迫下小麥抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響

2.3.1 藻粉處理對鹽脅迫小麥超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

如圖7所示，在處理后0～12 d對照組 CK的SOD活性呈緩慢上升的趨勢，而T0處理組SOD活性則呈現先上升后下降的趨勢，在6 d時其SOD活性達到最大，相比于對照組T0處理SOD活性顯著增加了24.7%。處理后3 d，各處理組SOD活性相比對照組顯著性上升，其中鹽脅迫處理組T0比CK增加了22%，在鹽脅迫處理6 d，各處理組SOD活性繼續增加，其中T3處理組增加最為顯著，相比于處理3 d時增加了27%。處理9 d時，各處理組之間SOD活性開始出現顯著性差異，其中T0和T1處理組SOD活性開始下降，相比于鹽脅迫6 d時分別下降了23.7%和30.2%，鹽脅迫12 d時，各處理組SOD活性開始維持穩定。

2.3.2 藻粉處理對鹽脅迫小麥過氧化物酶(POD)活性的影響

如圖8所示，在整個生長過程中，對照組CK 的POD活性隨著時間緩慢上升并維持穩定，而鹽脅迫處理組T0，在處理3 d，其POD活性相比于對照組顯著提高了59%，而后其POD活性隨著時間緩慢上升，在6 d時達到最大值，然后下降，在12 d達到最小。而添加藻粉處理使鹽脅迫下小麥POD活性得到回升，在9 d時，T2、T3和T4處理組POD活性顯著升高，分別相比于同期對照組提高了56.5%、71.2和53.1%，T1處理組無顯著變化。到12 d時，各藻粉處理組(T1～T4)POD活性均顯著高于T0，其中T2處理組的POD活性相比于T0顯著增加了133.5%。

2.3.3 藻粉處理對鹽脅迫小麥過氧化氫酶(CAT)活性的影響

由圖9可知，鹽脅迫3 d時，各處理組CAT活性均有顯著性升高，隨著時間的增加，對照組CK的CAT活性變化不大，而鹽脅迫處理組T0和各藻粉處理組CAT均呈先上升后下降的趨勢，其CAT活性在6 d達到最大，而后開始緩慢下降。9 d時，各處理組之間CAT活性開始出現顯著差異性，其中相比于3 d，T0和T1處理組的CAT活性顯著下降了34.3%和42.8%，而T3和T4處理組CAT活性略有下降但不顯著，T2處理組CAT活性的下降遠小于T0和T1處理組。到12 d時，各處理組CAT活性開始趨于穩定，各對照組和處理組CAT活性相比于9 d無顯著性變化。

圖9 藻粉對鹽脅迫下小麥過氧化氫酶活性的影響Fig.9 Effect of algae powder on CAT activity of wheat under salt stress

2.3.4 藻粉處理對鹽脅迫小麥丙二醛(MDA)含量的影響

由圖10可知，在處理3 d后，各處理組MDA含量有了明顯的上升，鹽脅迫處理組T0葉片中MDA含量隨處理時間開始緩慢升高，處理6 d時，各處理組MDA含量略有上升，但變化并不顯著，各處理組也沒有明顯的差異。鹽脅迫處理9 d時，T2、T3和T4處理組MDA含量出現顯著下降，相比于T0分別低了35.8%，42.3%和36.4%。鹽脅迫12 d時，各組MDA含量趨于穩定，相比于9 d的MDA含量沒有顯著性變化。

圖10 藻粉對鹽脅迫下小麥丙二醛含量的影響Fig.10 Effect of algae powder on MDA content of wheat under salt stress

2.4 藻粉處理對鹽脅迫下小麥Na+/K+的影響

本研究發現，在鹽脅迫條件下，小麥鹽脅迫對照組T0地上部和地下部的Na+/K+顯著升高，相比于對照組增大了958.7%和1 362.1%。而T3藻粉處理后有所下降，相比于T0組分別降低了54.3%和7.8%(圖11)。

圖11 藻粉對鹽脅迫下小麥幼苗Na+/K+的影響Fig.11 Effect of algae powder on Na+/K+in wheat seedlings under salt stress

3 討論

鹽脅迫是影響植物生長的非生物脅迫因子之一，鹽濃度超過植物耐受閾值時會出現植物生長發育受到抑制和光合作用效率下降等現象，影響植物生長。微藻可以分泌多種生物活性物質，如植物激素和胞外多糖等，這些物質能夠促進植物生長，改善土壤質量，減緩鹽脅迫對植物生長的抑制作用。本研究中，鹽脅迫處理組T0小麥幼苗的根長、莖長、干重和鮮重相比于對照組CK都有了明顯下降，說明小麥生長發育和物質積累受到嚴重抑制。而在添加藻粉處理后，各處理組小麥幼苗的各項生長指標都有了明顯增長。可能的原因是微藻分泌的多糖物質和生長刺激素促進了小麥幼苗的生長[16]；或者衣藻自身富集了大量的NaCl，減輕了植株受脅迫的程度。該試驗結果與Arroussi等[17]研究結果相一致。說明添加衣藻能夠促進植物在鹽脅迫條件下的生長。

可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內重要的滲透調節物質，其含量的變化反映了小麥滲透調節能力的變化[18-19]。植物遭受鹽脅迫時，細胞內的蛋白質分解成氨基酸的速率提高，蛋白質合成受阻，故可溶性蛋白含量下降[20]；而外源物質可以使受鹽脅迫的植物滲透調節能力恢復[21]，從而使受鹽脅迫植物的可溶性糖含量和可溶性蛋白含量增加[22]；這與本實驗結果一致。說明衣藻藻粉可能參與植物滲透調節，維持正常生理代謝活動。在本實驗中，經過12 d的鹽脅迫后，T0處理組的可溶性糖和可溶性蛋白的含量相比于同期對照組CK出現明顯下降，表明小麥細胞在高濃度鹽脅迫(150 mmol·L-1NaCl)的條件下逐漸失去了滲透調節能力，而添加藻粉的各處理組(T1～T4)其可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均出現不同程度的回升。綜上，本研究表明藻粉可以幫助受到鹽脅迫的小麥細胞恢復一定的滲透調節能力。而高濃度藻粉處理(1 g·L-1)顯著高于低濃度處理(0.25 g·L-1)，這表明藻液處理的作用效果跟濃度有很大關系，以1 g·L-1最為適宜。

當植物面臨各種脅迫時，植物體內積累活性氧(ROS)增多會引起植物細胞遭受氧化脅迫[23]，最終使植物細胞功能失常，植物生長受阻。SOD、POD和CAT是植物體內應對外部脅迫的抗氧化酶，當植物受到鹽脅迫時，植物體內出于自我防御的需要，會提高這些酶的活性，從而提高自身抗逆性。本試驗發現，當鹽脅迫3 d時，各處理組的SOD、POD和CAT的活性均持續上升，在處理后6 d時達到最大。這表明鹽脅迫對小麥自身抗氧化酶的活性有抑制作用。小麥幼苗體內抗氧化酶不足以清除積累過多的ROS，可能影響小麥生長。而在添加藻粉后，各處理組抗氧化酶的活性明顯升高，其中POD活性的提升最為明顯。這說明藻粉處理能夠有效增加小麥抗氧化酶的活性從而加快清理因鹽脅迫而積累在小麥體內的ROS，從而減緩鹽脅迫對植物的損傷。MDA是植物膜脂質過氧化的主要產物之一，其在植物體內含量的變化能直觀地反映植物細胞氧化損傷程度[24]。本研究中，在處理后3 d時，小麥葉片中MDA含量有了明顯上升。而添加藻粉處理后，抗氧化酶活性得到明顯提升，MDA含量也開始下降。這與其他生物肥料處理[25-26]對鹽脅迫下小麥的抗氧化酶活性和MDA含量的影響類似，這說明衣藻藻粉可有效降低小麥細胞氧化損傷程度，從而維持其正常功能，進而增強小麥的抗逆性并促進其生長。而在處理3～12 d期間，T3處理組的POD、SOD、CAT活性基本是最高的，而MDA含量卻是最低的，因此，1 g·L-1藻液處理效果最佳。

K+是所有高等植物里含量最多的離子，能夠參與調控植物離子平衡、參與蛋白質合成、參與光合作用、調節細胞滲透壓，是植物生長發育很重要的一種微量元素。而Na+元素因為其離子半徑和水合能與K+類似，能夠搶占細胞中K+的吸收位點，從而導致細胞對K+的吸收能力下降。因而，植物細胞內K+含量的穩定和較低的Na+/K+能反映細胞內離子平衡狀態[27]。而在鹽脅迫環境中，植物的Na+/K+會急劇增加直到超過其生長所能承受的最大臨界值[28]。這與本研究結果相同。而各藻粉處理組小麥根和葉片中Na+/K+顯著降低。這是因為藻粉處理改善了鹽脅迫條件下的土壤微環境，使小麥根際Na+含量降低[29]。本研究說明在鹽脅迫條件下添加一定濃度的衣藻藻液能有效維持小麥內部離子平衡，進而促進其生長。

4 結論

綜上所述，微藻能夠合成豐富的生物活性成分，為作物提供豐富的礦物質營養，促進農作物代謝生長[30]。本研究得出以下結論：藻粉處理能夠促進鹽脅迫下小麥植株的生長、促進其離子平衡的穩定并維持其滲透調節能力，一定程度上增加其抗氧化酶活性，使其抗鹽脅迫能力增強。