基于網絡藥理學探討新止骨增生丸治療膝骨關節炎的作用機制

龍云平 劉晗笑 徐中昊 金連峰

膝骨關節炎(osteoarthritis of the knee, KOA)是一種常見的慢性關節疾病, 以關節疼痛和活動受限為主要特征［1］。骨關節早期發生關節破壞導致關節炎癥介質失衡, 以軟骨變性、細胞外基質變性、全身炎癥、軟骨細胞凋亡、骨贅形成和骨重塑為特征［2］。西醫治療KOA 早期常用非甾體抗炎藥、糖皮質激素等［3］, 但長期服用會增加心臟、肝臟和腎臟疾病的風險［4］, 晚期主要通過關節置換手術治療, 但手術費用較高且術后具有一定的感染風險［5］。KOA 屬中醫學“骨痹”、“痹證”范疇, 即膝痹病, 以標本同治為治療原則, 基本治法為補益肝腎、活血化瘀, 兼祛風寒、清熱利濕［6］。新止骨增生丸是由遼寧中醫藥大學附屬醫院經過長時間的臨床試驗總結成方［7］, 主要功效為補肝腎強筋壯骨、活血通絡止痛, 藥物成分包括熟地黃、雞血藤、骨碎補(制)、肉蓯蓉、劉寄奴、海桐皮等。方中熟地黃、骨碎補、肉蓯蓉共為君藥, 全方藥物相輔相成、標本兼治, 共奏補肝腎、強筋骨、通絡止痛的功效, 用于治療KOA 療效確切［8］。藥效學研究表明新止骨增生丸具有良好的鎮痛、抗炎消腫、祛瘀的作用,且能有效降低關節滑液中的IL-1β、IL-6、白細胞介素-17(IL-17)等炎性因子水平, 抑制KOA 的進展［9］。本研究擬通過網絡藥理學方法進一步探討新止骨增生丸治療KOA 的作用機制, 以期為其進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 新止骨增生丸的活性成分及其作用靶點篩選 借助中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php/)和BATMAN-TCM 數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索新止骨增生丸中各味中藥的化學成分, 并以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18 為篩選條件, 獲取新止骨增生丸的活性成分。進一步通過TCMSP 平臺篩選活性成分的作用靶點, 并通過UniProt 數據庫(https://www.uniprot.org/)對蛋白靶點進行規范。

1.2 KOA 疾病相關靶點的預測 以“kneeosteoarthritis”為檢索詞, 通過GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://omim.org) 和DisGeNet(https//www.disgenet.org/)數據庫獲取KOA 的疾病相關靶點, 并通過Uniport數據庫進行規范。然后將新止骨增生丸的活性成分作用靶點與KOA 疾病相關靶點通過Venny2.1.0 在線分析工具進行映射, 取交集基因(共同靶點), 即得到新止骨增生丸治療KOA 的關鍵靶點。

1.3 PPI 網絡的構建 將新止骨增生丸治療KOA 的共同靶點導入String 平臺(https://Stringdb.org), 設置物種為“Homosapiens(智人)”, 使用MultipleProtein(多種蛋白質分析)功能, 蛋白相互作用分數(Minimumrequir edinteractionscore) 設 定“Mediumconfidence(＞0.400)”。下載PPI 網絡的TSV 文件, 將其導入Cytoscape3.7.1 軟件進行可視化分析, 構建PPI 網絡, 使用CytoNCA 插件計算度中心性(DC)、特征向量中心性(EC)、介度中心性(BC)和接近中心性(CC), 并選擇DC、EC、BC 和CC 大于中位數的靶點, 經過一次篩選, 得到的靶點被認為是核心靶點, 并建立核心靶點的PPI 網絡。

1.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 將“1.2”項下獲得的關鍵靶點(共同靶點)導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行GO 功能及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析包括生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和細胞組分(cellular component, CC)。設置P＜0.05, 并通過微生信在線平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)對結果進行可視化處理。將共同靶點、信號通路信息導入Cytoscape3.7.1 軟件, 構建“活性成分-關鍵靶點-通路”網絡圖。

1.5 活性成分-關鍵靶點-通路網絡圖構建 將“1.1”項下獲得的新止骨增生丸活性成分、“1.2”項下獲得的關鍵靶點(共同靶點)及“1.4”項下獲得的前20 條通路導入Cytoscape3.7.1 軟件, 構建新止骨增生丸治療KOA 的“活性成分-關鍵靶點-通路”網絡, 通過插件CytoNAC 計算網絡中成分節點進行拓撲分析, 反向篩選新止骨增生丸治療KOA 的有效成分及關鍵基因。

2 結果

2.1 新止骨增生丸的活性成分及其作用靶點 篩選新止骨增生丸中符合條件的活性成分, 分別得到熟地黃2 個、雞血藤23 個、骨碎補(制)18 個、肉蓯蓉5 個、劉寄奴3 個、海桐皮7 個, 去除重復后共得到54 個活性成分。其中有50 個活性成分能夠在數據庫中匹配到作用靶點, 將其對應的靶蛋白輸入UniProt 數據庫, 去除無效和重復靶點后共得到新止骨增生丸的活性成分作用靶點262 個。

2.2 新止骨增生丸治療KOA 的關鍵靶點 通過OMIM、GeneCards 和DisGeNet 數 據 庫 共 檢 索 得 到KOA 的疾病相關靶點2459 個, 與262 個新止骨增生丸活性成分作用靶點映射取交集, 共得到新止骨增生丸治療KOA 的關鍵靶點(共同靶點)142 個。見圖1。

圖1 新止骨增生丸活性成分靶點與KOA 靶點的韋恩圖

2.3 新止骨增生丸治療KOA 的共同靶點PPI 網絡將新止骨增生丸治療KOA 的142 個共同靶點導入String 平臺, 設置最低相互作用閾值置信度(＞0.4)構建蛋白互作網絡圖, 去掉1 個無連接的節點, 構建PPI網絡, 該網絡除去1 個游離靶點后, 共有141 個節點,3283 條邊。見圖2。將數據導入Cytoscape3.7.1 軟件,使用CytoNCA 插件計算網絡節點DC、EC、BC 和CC 值。先選出DC、EC、BC 及CC 大于中位數45、0.07421736、40.130833 及0.58577406 的 靶 點。經 過 一 次 篩 選,13 個靶點被確定為核心靶點。按DC 值排序依次為：TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、腫 瘤 蛋 白53(TP53)、IL-1β、JUN、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、胱天蛋白酶3(CASP3)、信號轉導及轉錄激活蛋白3(STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、環加氧酶3(PTGS2)、表皮生長因子(EGF)。圖2 和圖3 顯示：蛋白質-蛋白質相互作用, 線條越多, 關聯性越強, 作用也就越強。靶點節點越大, 表明其degree 值越大, 與其相關的靶點蛋白數量越多, 在網絡中的位置越核心。

圖2 新止骨增生丸治療KOA 的全部靶點PPI 網絡

圖3 新止骨增生丸治療KOA 的核心靶點PPI 網絡

2.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 利用DAVID數據庫和在線生物信息學分析工具, 富集分析了新止骨增生丸和KOA 的142 個共同靶標。富集結果顯示,GO 中BP 中有821 個詞條, CC 中有94 個詞條, MF 中有139 個詞條(P＜0.05)。通過重要性排序, 從CC、CC和MF 中選出了10 個最重要的詞條, 并繪制了條形圖。見圖4。新止骨增生丸治療KOA 所涉及的生物過程主要包括基因表達的正調節(positiveregulation of gene expression)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控(positive regulation of transcrip-tion from RNA polymeraseⅡpromoter)、藥物反應(response to drug)等；細胞組分方面包括細胞外間隙(extracellular space)、細胞外組分(extracellular region)、高 分 子 復 合 物(macromolecular complex)等；分子功能方面包括酶結合(enzyme binding)、相同蛋白質結合(identical protein binding)、蛋白質結合(protein binding)等。KEGG 通路富集分析得到167 條相關通路(P＜0.05), 根據顯著性進行排列, 選取排前20 位的條目繪制成氣泡圖, 見圖5。新止骨增生丸治療KOA 主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎(HepatitisB)、脂質與動脈硬化(lipid and atherosclerosis)、TNF 信號通路(TNF signaling pathway)等。

圖4 新止骨增生丸治療KOA 的 GO 功能富集分析

圖5 新止骨增生丸治療KOA 的KEGG 富集分析

2.5 新止骨增生丸“活性成分-關鍵靶點-通路”網絡圖構建 將KEGG 中前20 條通路及其相關靶點與關鍵靶點及其相關活性成分導入Cytoscape3.7.1 軟件,并生成“活性成分-核心靶點-通路”網絡圖。見圖6。圖中顯示橢圓形節點代表通路, 菱形節點代表靶點, 八邊形節點代表新止骨增生丸藥物中的活性成分, 節點大小與degree 值呈正相關。運用CytoNCA 插件計算網絡圖節點成分的DC、EC、BC、CC 的值, 其中包含223 個節點和1263 條邊。

3 討論

本研究借助網絡藥理學研究的方法篩選得到新止骨增生丸中的活性成分54 個。其中關鍵活性成分包含槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚等。槲皮素是黃酮類化合物家族的一員, 在退行性疾病中具有抗氧化和抗炎特性。有研究表明槲皮素通過激活SIRT1/AMPK 信號通路來抑制內質網應激和相關的細胞凋亡［10］。槲皮素可以上調超氧化物歧化酶(SOD)和基質金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1), 下調MMP-13, 通過減弱氧化應激反應和抑制軟骨細胞外基質的降解來改善骨關節炎(OA)［11］。另外一項研究表明槲皮素處理的KOA 大鼠的關節損傷模型中結節性硬化癥2(TSC2)和微管相關蛋白1 輕鏈3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)表達升高, 腦Ras 同源蛋白(RHEB)、p-mTOR、p-ULK1 和p62 表達下降, 通過介導TSC2-RHBE-mTOR 信號通路緩解了KOA［12］。有研究表明木犀草素可以影響原代兔關節軟骨細胞中MMP-3 的表達、分泌和活性, 起到潛在軟骨保護作用［13］。目前, 未見β-谷甾醇關于保護或緩解KOA 的直接報道。β-谷甾醇具有一定的抗炎、抗氧化作用［14］, 是否可以用于KOA 的治療有待驗證。

在基因數據庫中映射共同靶點, 并通過String 探索蛋白間相互作用關系, 得到TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、IL-1β、JUN、MMP-9 等核心靶點。有研究通過測量KOA 患者軟骨和滑液中VEGFA 的表達水平, 證實了KOA 進展過程中VEGFA 表達的增加［15］。使用hUSC-Exos 外泌體過表達miR-140-5p通過下調大鼠模型中的VEGFA 來緩解膝關節骨關節炎［15］。另外一項miRNA 和基因表達譜的綜合分析的研究［16］表明, BTG2、ABL2 和VEGFA 可被視為OA的潛在預測和治療生物標志物, 可能指導OA 的臨床治療。通過關節內注射木瓜蛋白酶建立大鼠OA 模型［17］,酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測到血清中高水平的TNF-α 和IL-1β, 使用槲皮素治療可明顯改善關節炎狀態, 降低血清中炎性因子水平。在IL-1β 處理軟骨細胞構建軟骨細胞關節炎模型中, 槲皮素還能緩解IL-1β 誘導的細胞活力下降和凋亡增加, 并促進軟骨細胞合成IL-1β 抑制的粘多糖［12］。IL-1β 誘導的核轉錄因子-κB(NF-κB)活化和軟骨細胞產生MMPs共同促進KOA 進展。有研究［18］表明異甘草素可以抑制IL-1β 誘導的關節軟骨細胞中MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 的產生。新止骨增生丸治療的KOA的關鍵靶點可以用于開發靶向抑制劑。

KEGG 通路富集分析結果, 主要涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路等。一項結合多組學數據的Meta 分析研究［19］表明, AGERAGE 信號失調是年齡相關KOA 性別依賴驅動因素。AGE 是晚期糖基化終產物, RAGE 是高級糖化終產物受體, 與各種慢性炎癥有關, 靶向RAGE 可以抑制炎癥和多種疾病的進展和轉移［20］。Wnt/β-catenin 信號傳導通路是調節關節炎發育和進展的獨特信號通路,通過直接影響骨骼、軟骨和滑膜組織, 在骨骼和關節病理學中發揮作用, 該特定通路中的分子可作為關節炎治療干預的靶標［21］, 源于富血小板血漿的外泌體通過Wnt/β-catenin 信號通路促進軟骨細胞的增殖和抑制軟骨細胞凋亡, 在緩解KOA方面展示出新的潛力［22］。此外, 物理性治療手段低強度脈沖超聲通過調節Wnt/β-catenin 信號傳導抑制成纖維細胞樣滑膜細胞增殖,并減少滑膜纖維化也有報道［23］。

綜上所述, 新止骨增生丸可能通過槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分作用于TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、IL-1β、JUN、MMP-9 等核心靶點,通過AGE-RAGE、TNF 和Wnt/β-catenin 信號通路等發揮緩解KOA 的作用。