基于機器學(xué)習(xí)篩選慢性鼻竇炎相關(guān)診斷基因及其與免疫微環(huán)境的關(guān)系分析

王珍珍 黃琦 黃鈞濤 沈毅 鄔振華

慢性鼻竇炎是目前臨床最常見的慢性疾病之一，以鼻竇黏膜炎癥、繼發(fā)自然引流通道阻塞而導(dǎo)致的一系列臨床癥狀為特征，如鼻塞、鼻涕、鼻后滴漏、面部脹痛、嗅覺減退或喪失、頭痛、疲勞甚至抑郁。慢性鼻竇炎會嚴重影響患者的生活質(zhì)量，加重經(jīng)濟負擔(dān)[1-2]。研究表明，慢性鼻竇炎具有臨床、病理和免疫多樣性，盡管其病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，但炎癥相關(guān)因素起著重要作用，主要表現(xiàn)為鼻竇黏膜的慢性炎癥，伴有大量淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞的炎性浸潤及黏膜上皮結(jié)構(gòu)的病理變化[3-4]。隨著基因測序及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，疾病的發(fā)病機制在基因?qū)用娴玫搅烁敿毜奶骄俊２捎蒙锘驕y序技術(shù)和機器學(xué)習(xí)算法相結(jié)合，可將目標對象的特征數(shù)據(jù)納入對應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，通過計算機迭代模擬，篩選出目標的候選相關(guān)特征[5-6]。基于此，本研究使用多種機器學(xué)習(xí)模型對慢性鼻竇炎的相關(guān)測序芯片進行分析，在此基礎(chǔ)上，篩選出慢性鼻竇炎的相關(guān)基因，并與慢性鼻竇炎免疫微環(huán)境中的炎性細胞進行相關(guān)性分析，探討其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 慢性鼻竇炎相關(guān)基因表達芯片獲取 從高通量基因表達（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫公開獲取慢性鼻竇炎疾病相關(guān)基因芯片，選擇GSE23552 芯片作為本次研究的訓(xùn)練集。該芯片由17 例慢性鼻竇炎樣本和22 例正常對照樣本組成，根據(jù)GPL 5175 平臺的探針注釋信息，對該芯片進行注釋，使用R 軟件的“l(fā)imma”程序包對該芯片進行標準化處理，獲得基因表達矩陣用于后續(xù)分析。本研究經(jīng)寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準文號：KY2023ML046）。

1.2 差異基因篩選、加權(quán)共表達分析及功能分析使用R 軟件的“l(fā)imma”程序包對上述GSE23552 芯片中的慢性鼻竇炎和正常對照樣本進行基因表達差異分析，篩選標準：（1）|log2FC|＞1（即兩組基因表達量的差異＞2 倍）；（2）校準后P＜0.05，當(dāng)基因同時滿足上述2 個條件時認為是慢性鼻竇炎樣本和正常對照樣本的差異基因。篩選后獲得的差異基因的表達分布情況通過基因熱圖和火山圖呈現(xiàn)。同時，采用加權(quán)共表達分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）對兩組樣本進行分析，篩選相關(guān)基因，選擇基因重要性＞0.5 和模塊相關(guān)性＞0.8 作為過濾標準，過濾并篩選疾病相關(guān)基因。對上述差異基因和加權(quán)共表達分析的結(jié)果取交集，即為候選慢性鼻竇炎的相關(guān)基因，用于進一步機器學(xué)習(xí)篩選。將上述交集基因輸入蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫（search tool for retrieval of interacting genes/proteins，STRING）在線分析網(wǎng)站，分析上述基因蛋白相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。此外，選擇P＜0.05 作為篩選標準對交集基因行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encylopaedia of genes and genomes，KEGG）分析，探究其潛在的生物學(xué)功能及有關(guān)信號通路。

1.3 機器學(xué)習(xí)篩選核心基因及驗證 分別使用最小絕對值收斂和選擇算子算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）、隨機森林算法以及支持向量機遞歸特征消除算法（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）對上述慢性鼻竇炎候選基因進行篩選，分別獲得3 種算法下的特征基因集，并對上述3 種算法的結(jié)果取交集，獲得慢性鼻竇炎疾病相關(guān)基因。使用箱式圖反映基因在慢性鼻竇炎樣本和正常對照樣本的差異顯著性，使用ROC 曲線的AUC 評估基因的診斷效能，并使用GSE179265 芯片作為外部隊列進行相關(guān)外部驗證。

1.4 慢性鼻竇炎免疫微環(huán)境分析 采用CIBERSORT 算法對訓(xùn)練集芯片進行免疫浸潤分析，對每個樣本中的22 種免疫細胞浸潤情況進行預(yù)測，并進行相關(guān)差異分析。此外，對慢性鼻竇炎樣本和正常對照樣本的免疫細胞浸潤情況進行差異比較，采用Spearman 秩相關(guān)對診斷基因與免疫細胞浸潤情況進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 慢性鼻竇炎差異基因篩選及加權(quán)共表達分析結(jié)果 基于|log2FC| ＞1，校準后P＜0.05 標準對GSE23552 芯片進行差異表達分析，共獲得309 個差異基因，其中126 個基因在正常對照樣本中上調(diào)，其余183 個基因在慢性鼻竇炎樣本中上調(diào)（圖1A，見插頁）。使用加權(quán)共表達分析對上述樣本進行聚類（圖1B，見插頁），篩選疾病相關(guān)基因模塊。如圖1C（插頁）所示，天青色、藍色、棕色模塊中的基因與慢性鼻竇炎相關(guān)，綜合考慮模塊的顯著性檢驗P值、圖1D（插頁）中的基因顯著性及圖1E（插頁）模塊相關(guān)性，選擇天青色模塊的總計214 個核心基因作為慢性鼻竇炎差異基因最終篩選結(jié)果。

圖1 慢性鼻竇炎候選基因的篩選（A：慢性鼻竇炎差異性基因火山圖；B：加權(quán)共表達對差異性基因進一步分析篩選出疾病相關(guān)基因模塊；C：分析各模塊基因與慢性鼻竇炎的相關(guān)性；D：各模塊基因的顯著性；E：選擇天青色模塊進行加權(quán)共表達分析，篩選出214 個相關(guān)基因）

2.2 慢性鼻竇炎差異基因PPI 網(wǎng)絡(luò)及功能分析 將上述309 個差異表達基因和214 個加權(quán)共表達分析模塊基因取交集后，共獲得184 個交集基因。將其輸入STRING 在線數(shù)據(jù)庫后，獲得其PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。使用R 軟件對交集基因行GO 富集分析（圖2A，見插頁），結(jié)果表明，上述184 交集基因主要參與白細胞游出、免疫反應(yīng)的細胞激活等生物學(xué)過程。KEGG 分析顯示（圖2B，見插頁），上述交集基因主要參與細胞因子-細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、中性粒細胞細胞外陷阱的形成等相關(guān)信號通路。

圖2 相關(guān)功能分析（A：基本本體富集分析；B：京都基因與基因組百科全書分析）

2.3 慢性鼻竇炎相關(guān)診斷基因機器學(xué)習(xí)篩選及驗證 LASSO 回歸結(jié)果表明，當(dāng)基因數(shù)為9 時該算法擬合效果最好，所篩選獲得基因包括PLP1、ADRA1A、CSRP1、SCN7A、ALX1、CD180、LPHN3、SLAMF6 和EVI2B（圖3A、B，見插頁）。隨機森林算法分析結(jié)果表明，當(dāng)決策樹數(shù)目為10 時模型擬合最優(yōu)，進而選擇重要性＞1 的基因作為候選診斷基因，包括CSRP1、PLP1、F13A1、CGNL1、FHL1、EMR3、GPR97、CD209、SPON1 和CCR3（圖3C、D，見插頁）。SVM-RFE 分析表明，SCN7A、ADRA1A、ALX1 和PLP1可作為疾病診斷的候選基因（圖3E，見插頁）。隨后，對上述結(jié)果取交集，PLP1 在3 種算法擬合下均考慮為慢性鼻竇炎相關(guān)基因（圖3F，見插頁），故考慮其為潛在的疾病相關(guān)診斷基因。

圖3 慢性鼻竇炎相關(guān)診斷基因的篩選（A、B：LASSO 回歸得出擬合效果最好的9 個候選基因；C、D：隨機森林算法分析得出擬合效果最好的10 個候選基因；E：SVM-RFE 分析得出4 個候選基因；F：3 種算法取交集得出最終得慢性鼻竇炎相關(guān)診斷基因PLP1）

對PLP1 進行相關(guān)性驗證，結(jié)果表明，PLP1 基因在訓(xùn)練集（GSE23552）和驗證集（GSE179265）均表現(xiàn)為在慢性鼻竇炎樣本中下調(diào)（圖4A、B），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ROC 曲線顯示，PLP1 在訓(xùn)練集中的AUC 為1.000（圖4C），在驗證集中的AUC 為0.950（圖4D），表明該基因有良好的診斷效能。

圖4 PLP1 進行相關(guān)性驗證（A、B：PLP1 在2 個慢性鼻竇炎樣本集中表現(xiàn)為下調(diào)；C：PLP1 在訓(xùn)練集中的ROC 曲線；D：PLP1 在驗證集中的ROC 曲線）

2.4 慢性鼻竇炎免疫微環(huán)境探究 采用CIBERSORT算法對訓(xùn)練集芯片中22 種免疫細胞浸潤情況行免疫浸潤分析預(yù)測，各免疫細胞在每個樣本中的分布情況及占比見圖5A（插頁）。隨后，對22 種免疫細胞的浸潤情況作差異分析（圖5B，見插頁），結(jié)果表明慢性鼻竇炎樣本中的漿細胞、CD8 T 細胞、活化NK細胞、單核細胞和M0 巨噬細胞較正常對照樣本顯著減少，而M2 巨噬細胞、靜息肥大細胞和嗜酸性粒細胞顯著增加。Spearman 秩相關(guān)分析顯示，PLP1 基因表達與漿細胞、CD8 T 細胞、活化NK 細胞、單核細胞、M0 巨噬細胞和M1 巨噬細胞浸潤呈正相關(guān)，與M2 巨噬細胞、靜息肥大細胞、靜息樹突細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤呈負相關(guān)（圖5C、D，見插頁）。其中，PLP1 表達量與嗜酸性粒細胞浸潤相關(guān)系數(shù)r=-0.7（P＜0.001）。

圖5 PLP1 表達量與慢性鼻竇炎免疫微環(huán)境分析（A：CIBERSORT 對22 種免疫細胞浸潤情況分析；B：Spearman 秩相關(guān)分析PLP1基因表達量與嗜酸性粒細胞的相關(guān)性；C：22 種免疫細胞的浸潤情況的差異分析；D：PLP1 表達量與各細胞相關(guān)系數(shù)顯示）

3 討論

慢性鼻竇炎為耳鼻咽喉頭頸外科常見疾病之一，是一種病因復(fù)雜、復(fù)發(fā)率高的鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病。隨著對慢性鼻竇炎遺傳學(xué)的深入探索，研究表明慢性鼻竇炎患者具有良好的遺傳突變特征[7-8]，但對其是否表現(xiàn)出可識別的單基因改變卻缺乏研究。在此基礎(chǔ)上，本文對公開的測序數(shù)據(jù)庫中有效數(shù)據(jù)進行整合，通過加權(quán)共表達分析得出慢性鼻竇炎相關(guān)候選基因，通過PPI 網(wǎng)絡(luò)及GO 富集分析與KEGG 分析得出上述候選基因主要位于細胞膜，與免疫相關(guān)反應(yīng)有關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)其通過白細胞介導(dǎo)免疫、免疫反應(yīng)的細胞激活、白細胞趨化反應(yīng)、免疫效應(yīng)過程的調(diào)節(jié)等發(fā)揮生物學(xué)作用，本研究顯示慢性鼻竇炎的發(fā)生、發(fā)展與細胞因子-細胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路等相關(guān)信號通路密切相關(guān)，這與之前的研究一致[9-10]。

研究表明PLP1 是髓鞘形成中最豐富的蛋白質(zhì)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究被廣泛報道[11-12]。除神經(jīng)系統(tǒng)病變外，PLP1 在其他疾病中也有相關(guān)研究，有文獻報道原發(fā)性癌癥患者中PLP1 的高水平表達與總體生存時間呈負相關(guān)[13]，PLP1 可作為子宮肌瘤的潛在生物標志物[14]。本研究通過3 種算法對候選基因進行交集分析，最終得到潛在疾病相關(guān)診斷基因PLP1，并通過診斷ROC 曲線驗證PLP1 在慢性鼻竇炎中的診斷效能，所研究的2 個數(shù)據(jù)集的AUC 為分別為1.000 和0.950，驗證了PLP1 的診斷特異性，表明PLP1 可以作為慢性鼻竇炎的診斷基因，并可指導(dǎo)后續(xù)的相關(guān)分子生物學(xué)水平的研究。

巨噬細胞存在于各種組織中，在機體的發(fā)育、組織重塑、傷口愈合、血管生成和代謝中擔(dān)任著重要角色。巨噬細胞根據(jù)其分泌的不同炎癥介質(zhì)及基因特征分為不同的亞型，每種亞型的免疫作用各不相同[15]。隨著對慢性鼻竇炎患者免疫微環(huán)境的深入探索，研究表明慢性鼻竇炎中M2 型巨噬細胞數(shù)量在一定程度上有所增加，其主要通過復(fù)雜的免疫反應(yīng)和組織重塑來調(diào)節(jié)慢性鼻竇炎的發(fā)病機制并影響鼻竇炎的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸[16-17]。巨噬細胞是鼻黏膜中嗜酸性粒細胞趨化因子的重要細胞來源，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生[18]。研究表明在慢性鼻竇炎，特別是嗜酸性慢性鼻竇炎的發(fā)展過程中，嗜酸性粒細胞作為重要的效應(yīng)細胞發(fā)揮作用，其作為一種有害的免疫細胞，加劇局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致治療效果不佳，增加了并發(fā)癥的風(fēng)險[19]。本研究對慢性鼻竇炎患者標本中的22 種免疫細胞浸潤情況行免疫浸潤分析及差異性分析，顯示CRS 中嗜酸性粒細胞、M2 巨噬細胞顯著增加，而M0 巨噬細胞較正常樣本顯著減少。對PLP1 基因與免疫細胞進行相關(guān)性分析，顯示PLP1 基因表達與M0 巨噬細胞和M1 巨噬細胞浸潤呈正相關(guān)，與M2 巨噬細胞、嗜酸性粒細胞浸潤呈負相關(guān)，進一步表明了PLP1 作為低表達基因與慢性鼻竇炎的免疫相關(guān)性，影響著慢性鼻竇炎的預(yù)后及復(fù)發(fā)，顯示其臨床意義。

本研究尚有不足之處，盡管通過機器學(xué)習(xí)得出PLP1 可作為慢性鼻竇炎的診斷性基因，與慢性鼻竇炎的免疫微環(huán)境存在一定的相關(guān)性，但尚缺乏PCR 等相關(guān)實驗數(shù)據(jù)支撐驗證。

綜上所述，本研究運用機器學(xué)習(xí)得出慢性鼻竇炎的發(fā)病機制中的相關(guān)診斷基因為PLP1，并初步推斷出相關(guān)基因可能的作用機制及其與慢性鼻竇炎嗜酸性粒細胞的相關(guān)性，為后續(xù)進一步機制及通路的研究提供了方向。