氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性效應

吳 遲，李 敏，劉新剛，崔少青，孫 田，何明遠*

（1.中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2.廣西思浦林科技有限公司，南寧 530001）

氟吡菌酰胺（fluopyram）是德國拜耳作物科學公司開發的苯甲酰胺類殺菌劑和殺線蟲劑，其作用機理為抑制病原菌和線蟲的琥珀酸脫氫酶的活性，阻礙線粒體呼吸，干擾細胞的分裂和生長，進而防止真菌病害及線蟲的發生[1]。

目前酰胺類殺菌劑在全球的使用量逐年遞增，2016年，靶向琥珀酸脫氫酶的殺菌劑全球銷售額為17億美元，占全球農藥市場的3%[2]。其中，氟吡菌酰胺具有內吸性強、高效、廣譜等優點，已在歐盟、美國、中國等國家和地區登記使用，可有效防治黃瓜、番茄等多種作物線蟲、白粉病、靶斑病、炭疽病[3]。宋益民等[4]在番茄田施用氟吡菌酰胺產品，對根結線蟲的防效最高可達75%，并使番茄增產；韓瑞華等[5]研究發現，在甘薯田施用41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑可促進甘薯的生長，對甘薯黑斑病、軟腐病和線蟲病的防效分別達82.7%、75.6%和81.13%。目前，關于氟吡菌酰胺的研究除防治效果外，較多關注于其毒性，研究對象以鼠類為主。氟吡菌酰胺會通過干擾雌烷受體和雄烷受體基因的表達，造成雌鼠的肝臟細胞癌變[6]；雄鼠會產生過量的甲狀腺激素并形成甲狀腺腫瘤[7]。但是農藥在使用過程中不可避免地會流入環境中，對非靶標生物產生毒害作用。目前關于氟吡菌酰胺對環境有益非靶標生物的毒性效應的研究成果非常有限，因此有必要開展相關研究評價其環境安全性。

本文以97%氟吡菌酰胺原藥為試驗藥劑，分別測定8種非靶標生物（表1）的急性毒性，為氟吡菌酰胺的合理使用提供數據支撐。

表1 供試生物

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試藥劑

97%氟吡菌酰胺原藥由農業農村部農藥檢定所提供。

1.1.2 試驗儀器

紫外-可見分光光度計，舜宇恒平UV-2600；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安LDZM-60KCS；電子天平，梅特勒-托利多ME104/02；可調式移液器，10～100 μL、20～200 μL、100～1 000 μL、500～5 000 μL；超聲波清洗器，昆山KQ-250DE；便攜式溶解氧測定儀，衡欣AZ8403型；溫濕度計，山東仁科RS-WS-WIFI-Y4；數字式照度表，TES-1330A；便攜式pH計，衡欣AZ9861型；人工氣候箱，寧波賽福PRX-350B；不銹鋼鳥籠；蜂盒；量筒；容量瓶；燒杯等。

1.2 試驗方法

氟吡菌酰胺對8種非靶標生物的急性毒性試驗參照GB/T 31270—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則》進行，同時對水生生物試驗濃度進行檢測。

1.2.1 非靶標生物急性毒性試驗

（1）日本鵪鶉急性徑口毒性試驗：選用體重約為100 g的日本鵪鶉為試驗用鳥，試驗開始前12 h禁食。采用膠囊法進行經口染毒，設置有效成分質量分數為2.00×103mg/kg（b.w.）的試驗處理，每個膠囊的平均裝藥量為0.206 g，每只鵪鶉灌喂1個裝藥膠囊，染毒后的鵪鶉放置于鳥籠中，2 h后正常喂食。同時設置空白對照（灌喂1顆空膠囊），各處理組重復10只鵪鶉，雌雄各5只。試驗周期為7 d，試驗溫度（26±1）℃，光暗周期12 h/12 h（光照/黑暗）。藥劑處理8、24、48、72、96、120、144和168 h時分別觀察試驗用鳥的中毒及死亡情況，計算半致死劑量LD50（7 d）。

（2）意大利蜜蜂急性經口毒性試驗：使用二甲基亞砜和吐溫-80助溶氟吡菌酰胺，用50%的蔗糖水配制試驗藥液，以121 μg/蜂（有效成分用量）進行試驗處理。試驗用蜂麻醉后移入蜂籠中，將裝有藥液（200 μL）的飼喂管懸掛在蜂籠上，待蜜蜂取食藥液并消耗完畢后取出飼喂管，換50%的蔗糖水正常飼喂，根據實際消耗藥劑重量計算染毒劑量。同時設置空白對照和溶劑對照，各處理組3個重復，每重復10只蜜蜂。試驗周期為48 h，試驗溫度（25±1）℃，全程黑暗。染毒24和48 h分別觀察蜜蜂的中毒及死亡情況，并計算半致死劑量LD50（48 h）。

（3）意大利蜜蜂急性接觸毒性試驗：使用丙酮助溶氟吡菌酰胺并配制成質量濃度為5.00×104mg/L的儲備液。將蜜蜂麻醉后，在每只蜜蜂的中胸背板點滴2 μL的儲備液，得到100 μg/蜂的試驗處理。在各處理蜜蜂恢復前裝入蜂籠，飼喂適量的糖水。同時設置空白對照和溶劑對照，各處理組3個重復，每重復10只蜂。試驗周期為48 h，試驗溫度（25±1）℃，全程黑暗。染毒24和48 h分別觀察密蜂的中毒及死亡情況，并計算半致死劑量LD50（48 h）。

（4）家蠶急性毒性試驗（浸葉法）：使用二甲基亞砜和吐溫-80助溶氟吡菌酰胺，并配制成質量濃度分別為400、460、529、608、700和805 mg/L的試驗藥液，將（5.0±0.5）g的桑葉浸泡在50 mL藥液中，藥液在葉片表面均勻分布后陰干。葉片放至12 cm的培養皿中，接入2齡起蠶。同時設置空白對照和溶劑對照，各處理組3個重復，每重復20頭蠶。試驗周期為96 h，試驗溫度（25±1）℃、濕度（80±5）%。染毒24、48、72和96 h分別觀察試驗用蠶的中毒及死亡情況，并計算半致死濃度LC50（96 h）。

（5）玉米螟赤眼蜂急性毒性試驗：用丙酮溶解并配制成質量濃度為295 mg/L的氟吡菌酰胺藥液。采用藥膜法，添加0.700 mL的試驗藥液于螺口瓶中，用烤腸機滾勻吹干成藥膜，得到6.26 μg/cm2的試驗處理，黑暗條件下備用。將羽化后48 h的玉米螟赤眼蜂接入藥膜管中，封口（60±2）min后，將赤眼蜂轉入無藥的螺口瓶中，飼喂適量的10%蜂蜜水并用黑棉布封口。同時設置空白對照和溶劑對照，每管100頭赤眼蜂。試驗周期為24 h，試驗溫度（25±1）℃，濕度（75±5）%，全程黑暗。染毒24 h觀察赤眼蜂的死亡情況，根據半抑制率LR50（24 h）計算安全系數。

（6）赤子愛勝蚓急性毒性試驗：用丙酮溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質量濃度為1.00×104mg/L的儲備液。10 g石英砂中加入14.5 mL儲備液，混合均勻放置通風櫥使丙酮全部揮發后，與1 490 g人工土壤混合均勻，得到質量分數為100 mg/kg的試驗用土。同時設置空白對照和溶劑對照，各處理組3個重復，每重復10條蚯蚓。試驗周期為14 d，試驗溫度（20±1）℃，濕度（80±5）%，全程光照，光照強度（600±50）lx。染毒7和14 d分別觀察蚯蚓的中毒及死亡情況，并計算半致死濃度LC50（14 d）。

（7）斑馬魚急性毒性試驗：用曝氣水溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質量濃度為100 mg/L的試驗藥液，每24 h全部試驗藥液更換1次。同時設置空白對照，不設置重復，各處理組7尾魚。試驗周期為96 h，試驗溫度（22±1）℃，pH為8.3±0.1，溶解氧含量（90±5）%，光暗周期16 h/8 h（光照/黑暗），水硬度180 mg/L（以CaCO3計）。在染毒后24、48、72和96 h分別觀察斑馬魚的中毒及死亡情況，并計算半致死濃度LC50（96 h）。

（8）大型溞急性活動抑制試驗：用曝氣水溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質量濃度為100 mg/L的儲備液，設置26.9、35.0、45.5、59.2、76.9和100 mg/L 6個試驗處理，每24 h全部試驗藥液更換1次。同時設置空白對照，各處理組4個重復，每重復5只溞。試驗周期為48 h，試驗溫度（20±1）℃、pH8.3±0.1，光暗周期16 h/8 h（光照/黑暗），水硬度180 mg/L（以CaCO3計）。在染毒后24和48 h分別觀察試驗用溞的中毒及死亡情況，并計算半數抑制濃度EC50（48 h）。

（9）羊角月牙藻生長抑制試驗：用BG11培養基溶解氟吡菌酰胺原藥并配制成質量濃度為100 mg/L的儲備液，設置4.68、6.79、9.84、14.3、20.7和30.0 mg/L 6個試驗處理，使處理的藻細胞初始濃度為5.00×104個/mL，各處理組染毒藻液轉入250 mL的三角瓶中，并置于智能人工氣候箱培養72 h。同時設置空白對照，各處理組3個重復，每重復90 mL。試驗周期為72 h，試驗溫度（23±1）℃，pH為8.02±0.5，全程光照，光照強度（7 100±100）lx。在染毒后24、48和72 h分別觀察記錄各錐形瓶內藻細胞的數量，并根據生物量生長抑制百分率和生長率抑制百分率來分別計算EyC50（72 h）和ErC50（72 h）。

1.2.2 水生分析方法的建立

在斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻的急性毒性試驗中，分別收集氟吡菌酰胺在羊角月牙藻急性毒性試驗開始0和72 h的藻液、斑馬魚和大型溞急性毒性試驗開始0和24 h的試驗藥液進行測定，若氟吡菌酰胺的濃度變化超過20%，則使用實際濃度表示結果，反之使用理論濃度。

1.2.2.1 提取凈化

將收集的試驗藥液取2 mL至離心管中，加入2 mL乙腈，充分混勻，2 500 r/min振蕩2 min，收集混合液體過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.2.2.2 分析條件

采用高效液相色譜儀（島津LC-40 DXR）對氟吡菌酰胺進行分析檢測。儀器條件為：色譜柱Shim-pack GIST C18（100 mm×2.1 mm，2 μm），進樣體積5 μL，柱溫箱40℃，流動相0.1%甲酸水＋乙腈（體積比35∶65），流速0.3 mL/min，采集時間4.5 min，檢測器類型為紫外檢測器SPD-40，檢測波長210 nm。

1.2.2.3 標準曲線

在1.2.2.2部分描述的儀器分析方法條件下，分析檢測質量濃度為0.100、0.500、1.00、5.00、10.0、50.0、80.0、100、150 mg/L的標樣溶液，擬合峰面積和溶液濃度的標準曲線。

1.2.2.4 添加回收和精密度

分別向魚和溞培養基（去氯自來水）中添加氟吡菌酰胺標準品，配制質量濃度為1.50和120 mg/L的溶液；向藻類培養基（BG11）中添加氟吡菌酰胺標準品，配制質量濃度為0.500和50.0 mg/L的溶液，各質量濃度均設置5個重復，測定濃度，計算回收率。按照3倍信噪比（S/N）計算得出氟吡菌酰胺在魚和溞培養基中的檢出限為2.15×10-2mg/L，定量限為最低添加濃度1.50 mg/L；在藻培養基中檢出限為2.21×10-2mg/L，定量限為最低添加濃度0.500 mg/L。

1.3 數據分析與毒性劃分

使用SPSS 25.0軟件分析氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性結果以及95%置信區間，毒性等級按《化學農藥環境安全評價試驗準則》標準進行劃分。

2 結果分析

2.1 水生實測濃度

氟吡菌酰胺在去氯自來水和BG11培養基中的回收率為94.6%～105.0%（表2）。在去氯自來水中的檢出限為2.15×10-2mg/L，定量限為1.50 mg/L；在BG11培養基中的檢出限為2.21×10-2mg/L，定量限為0.500 mg/L。

表2 氟吡菌酰胺的平均添加回收率

試驗結果顯示，氟吡菌酰胺在水中的實測濃度（表3）均低于理論濃度的80%，因此，采用實際濃度計算氟吡菌酰胺對水生生物的急性毒性。

表3 氟吡菌酰胺在水生急性毒性試驗中的實測濃度

2.2 急性毒性結果

氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性測定結果見表4。

表4 氟吡菌酰胺對非靶標生物的急性毒性

氟吡菌酰胺對日本鵪鶉半致死劑量大于2.00×103mg/kg（b.w.），受試鵪鶉未出現死亡和明顯的中毒癥狀，毒性等級為低毒；對意大利蜜蜂經口半致死劑量大于112 μg/蜂、接觸半致死劑量大于100 μg/蜂，受試蜜蜂未出現死亡和明顯的中毒癥狀，毒性等級為低毒；家蠶半致死濃度為702 mg/L，受試家蠶出現拒食、身體變軟、身體扭曲、吐液、側倒、假死、生長緩慢等中毒癥狀，毒性等級為低毒；對玉米螟赤眼蜂半抑制率大于6.26 μg/cm2，受試赤眼蜂未出現死亡和明顯的中毒癥狀，風險性等級為低風險；赤子愛勝蚓半致死濃度大于100 mg/kg，受試蚯蚓未出現死亡和明顯的中毒癥狀，毒性等級為低毒；斑馬魚半致死濃度大于15.8 mg/L，受試魚未出現死亡和明顯的中毒癥狀，毒性等級為低毒；大型溞半數抑制濃度為7.01 mg/L，受試溞出現游動能力減弱、附肢輕微顫動、原地轉圈游動等中毒癥狀，毒性等級為中等毒；羊角月牙藻EyC50（72 h）為0.675 mg/L、ErC50（72 h）為2.41 mg/L，受試藻液出現無色透明、顏色較淺等抑制效應，毒性等級為中等毒。

3 結語

非靶標生物在環境生態系統中發揮著十分重要的作用，因此國內外均非常重視農藥對非靶標生物毒性風險的相關研究。本文利用不同的方法測定了氟吡菌酰胺對8種非靶標生物的急性毒性，為氟吡菌酰胺的應用補充了生態毒理學數據。研究結果表明，氟吡菌酰胺對陸生生物和水生生物斑馬魚的毒性等級為低毒，對水生大型溞和羊角月牙藻的毒性等級為中等毒，因此，氟吡菌酰胺在實際田間施用時應注意對水溞等水生生物的保護，施藥時遠離水產養殖區，避免在水體中清洗施藥用具。

自科聚亞公司于1966年開發了第一個酰胺類殺菌劑以來，經過幾十年的發展，酰胺類殺菌劑現有的代表性品種有甲霜靈、噻呋酰胺、環酰菌胺和氟唑菌苯胺等[8]。楊石有等[9]測定了噻呋酰胺和環酰菌胺2種酰胺類殺菌劑對4種非靶標生物的急性毒性，結果表明，噻呋酰胺對意大利蜜蜂急性經口、家蠶、赤子愛勝蚓、斑馬魚的毒性等級依次為中等毒、低毒、低毒和中等毒；環酰菌胺對意大利蜜蜂急性經口、家蠶、赤子愛勝蚓、斑馬魚的毒性等級依次為中等毒、低毒、低毒和中等毒。顧林玲[10]研究發現，氟唑菌苯胺對日本鵪鶉急性經口、鯉魚、水溞、羊角月牙藻的毒性等級依次為低毒、高毒、中等毒和低毒。韓文浩等[11]測定了吡噻菌胺對3種水生非靶標生物的急性毒性，結果表明，吡噻菌胺對斑馬魚胚胎、大型溞、藻類的毒性等級均為中等毒。因此，根據文獻報道可知，與氟吡菌酰胺相比，其他酰胺類殺菌劑同樣對陸生生物的毒性較低，并對水生生物具有較高的毒性效應，但是氟吡菌酰胺對非靶標生物的毒性比多數酰胺類殺菌劑更低。因此，在殺菌廣譜、高效的酰胺類殺菌劑中，氟吡菌酰胺是對環境生物毒性較低的種類之一，本文為氟吡菌酰胺安全使用提供了有力的數據支撐。

在評估農藥施用于田間的風險時，除考慮對環境生物的毒性外，還應根據施用量、施用方法和農藥理化性質等其他因素進行風險評估[12]。美國和歐盟早已開展了風險評估相關工作并建立了完整的評估體系，我國也在2016年發布了NY/T 2882—2016《農藥登記環境風險評估指南》，促使了我國風險評估程序規范化的實現。農藥對環境的風險分析包括暴露分析、效應分析和風險表征三步驟，暴露分析是通過農藥的施用量和施用方法等信息確定其在環境中的暴露濃度，效應分析是通過農藥對環境生物的急性或慢性毒性數據進行計算，風險表征是結合暴露分析和效應分析的結果評估農藥在田間施用的風險[13]。雖然，氟吡菌酰胺等酰胺類殺菌劑對環境生物的毒性較低，但應根據藥劑的具體GAP信息判斷其對環境生物的安全性。