土壤活化技術的研究進展與展望

陳光明，張 敏，史朝艾，曹坳程，王秋霞，顏冬冬，方文生，李 園

（中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193）

農業集約化種植是近年來農業生產方式的一個重要發展方向。在農業集約化種植過程中，長期連作種植制度可以帶來豐厚的回報，但會引發一系列的土壤健康問題。土壤熏蒸消毒是解決該問題的有效方法之一，即在種植作物前，向土壤中注入揮發性化合物，以控制土傳病原真菌、線蟲和雜草的蔓延[1-2]。常用的熏蒸劑包括棉隆（dazomet，DZ）、1,3-二氯丙烯（1,3-dichloropropene，1,3-D）、氯化苦（chloropicrin，CP）、威百畝（metam-sodium，MS）、二甲基二硫（dimethyl disulfide，DMDS）、異硫氰酸甲酯（methyl isothiocyanate，MITC）等[3]。熏蒸劑在中國的登記情況如表1所示。

表1 熏蒸劑登記情況

氯化苦熏蒸性能顯著，在土壤中降解迅速，對非靶標生物無明顯毒理效應。目前，氯化苦在中國使用受限[4]，在荷蘭、美國等國家處于再評審階段[4-5]。二甲基二硫未在中國登記，但是采用滴灌聯用、注射聯用等技術與棉隆、威百畝以及1,3-二氯丙烯復配，田間防治根結線蟲效果顯著[6]。目前，該熏蒸劑正在爭取登記[7]。威百畝除草性能優異，可與其他熏蒸劑復配。但總體而言，我國化學熏蒸劑的總登記量較少，制約了未來土壤消毒工作的發展。

熏蒸劑的使用存在利弊。熏蒸劑具有廣譜性，不僅可以殺死土傳病原真菌，還會殺死土壤中的有益昆蟲和微生物，導致群落結構的失衡[8]。研究表明，熏蒸處理會降低土壤微生物的代謝活性、真菌的生物量和多樣性。雖然細菌群落在短時間內能從熏蒸抑制中恢復，但真菌被抑制的持續時間較長，不利于土壤根際復雜群落的重建[9]。健康的土壤環境需要依靠微生物物種間復雜的等級性和傳遞性維持群落的動態平衡[10]。

熏蒸后的土壤微生物環境近似為真空狀態，隨時可能因為外來病原菌的侵入造成病害再次傳播[11]。為了緩解熏蒸劑對環境的負面效應，一方面，應開發使用新型環境友好型熏蒸劑，如乙蒜素（ethylicin）、異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）等[12]；另一方面，在熏蒸后種植作物時，將有益微生物制劑、腐殖質、硅肥和生物炭等物質添入土壤中，以促進土壤微生物群落快速恢復，直接或間接地促進對土傳病原菌的抑制作用[13-14]。

1 生物肥料

1.1 概述

生物肥料是富含有益微生物，用于抑制植物病原體、促進植物生長的產品[15]。有益微生物包括細菌、真菌或藻類來源的活有機體。微生物通過生化過程輔助植物吸收營養，分泌抗生素，與植物病原體競爭營養及誘導植物系統抗性（ISR）[16-17]。具備促進植物生長潛力的細菌和真菌被稱為根際促生細菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）和根際促生真菌（plant growth promoting rhizofungi，PGPF）[18]。圖1所示的根際促生細菌、植物和土傳病原菌的關系說明了根際微生物發揮功能的直接作用與間接作用[19]。

圖1 根際促生細菌（PGPR）、植物與病原菌的關系

中國登記的生物肥料類型繁多：①依據微生物濃度，可分為微生物菌劑和微生物濃縮劑；②依據與其他肥料的復配方式，可分為生物有機肥和復合生物肥；③依據微生物的功能，可分為有機物料腐熟劑、土壤修復菌劑和生物修復菌劑。在全球生物肥料市場中，固氮生物肥占80%，主要包括固氮菌屬（Azotobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）、固氮螺菌屬（Azospirillum）等；磷酸溶解肥占14%[20]。

本文以生物肥料中有益微生物為例，探討生物肥料市場上典型微生物種類在土壤活化方面的應用。

1.2 根際細菌類

固氮菌屬（Azotobacter spp.）通過釋放吲哚乙酸等植物激素及揮發性煙酸、泛酸和生物素等生物物質促進根系健康生長[21]。除了固氮作用外，固氮菌屬還具有根際細菌群落構建，緩解作物生長逆境脅迫，減少化學氮肥施用等功能[22-23]。

以假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）中的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）分泌的次級代謝物作為信號因子，促進巴西固氮螺桿菌（Azospirillum brasilense）上調nirK和nifX-nifB基因，最終導致固氮作用硝基含量的增加。另一方面，假單胞菌屬可以上調amtb1和amtb2基因的表達，并調節內部氨庫銨鹽的釋放[24]。假單胞菌屬促進植物生長的作用機制還涉及溶解磷酸鹽、分泌生長素和揮發性有機物丙酮等。

芽孢桿菌（Bacillus spp.）分泌磷酸酶和有機酸，可以溶解土壤中的磷酸鹽，提高磷肥利用率。如枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢桿菌亞種植物芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens subsp.plantarum）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和短小芽孢桿菌（B.pumilus），在促進植物生長和抑制病原菌方面效果顯著[25-26]。增施芽孢桿菌磷肥，可以提高土壤微生物群落的遺傳多樣性和功能多樣性，增強土壤代謝酶活性，減少化學磷肥的使用量[27]。Hui等[28]在土壤樣品中接種氨化解淀粉芽孢桿菌，發現其促進了土壤氮的礦化。

生物肥料的連續施用，是維持生物肥料肥效的手段之一，同時有利于鑒定出土壤中長期定殖的有益微生物，作為待開發菌株備選。研究表明，連續3年施用含解淀粉芽孢桿菌與堆肥混合物的生物有機肥，可在土壤中分離到可培養細菌，如厚壁菌門（Firmicutes）、γ-變形菌門（Gammaproteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）等[29]。連續9年施用生物有機肥，核桃田土壤中有益微生物芽孢桿菌、環境修復菌（Solicoccozyma spp.）增加顯著[30]。

1.3 根際真菌類

真菌類生物肥料研究的重點主要包括木霉菌根際真菌和曲霉等。木霉（Trichoderma）具有抗真菌特性，可以促進植物生長并誘導其對病原微生物產生耐藥性[31-33]。如木霉通過刺激植株分泌次生代謝和防御酶來增強番茄對根結線蟲的抗性，有效控制鐮刀菌屬（Fusarium spp.）和疫霉菌屬（Phytophthora spp.）等土傳病原菌[34-35]。在理化性質方面，在秸稈好氧發酵過程中，添加木霉可提高土壤有機碳含量和團聚體的穩定性[36]；添加綠色木霉（Trichoderma viridis）可促進秸稈纖維素降解，縮短堆肥周期[37]。在木霉的促進機制方面，向有機堆肥中添加貴州木霉（Trichoderma guizhouense）制備生物有機肥。利用滅菌與非滅菌的盆栽試驗，證明非滅菌土壤的生物因素驅動了植株鮮重增加；通過泥漿試驗，發現真菌對增產發揮了重要的作用，并從土壤真菌中鑒定出關鍵真菌曲霉A.tamarii和A.niger[38]。另一方面，土壤中原生生物對木霉具有協同作用。從施用木霉的土壤中分離的原生動物群落中鑒定出微食性草履蟲原生生物。原生生物與木霉相結合，促進了作物產量的提高[39]。

菌根是植物根與土壤真菌的共生組合，主要包括外生菌根、內生菌根、內外生菌根、叢枝菌根等[18]。研究表明，西洋參連作，導致土壤環境變差，根腐病指數和土壤硝酸鹽含量增加。在接種叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza）真菌后，緩解了上述負面效應[40]。作物間作，接種叢枝菌根真菌，可改善作物品質，提高中藥材中有效成分產量[41]。

曲霉（Aspergillus）通過淋水法與堆肥結合后，可以促進石灰質土壤中磷和鉀的溶解，減少磷、鉀化學肥料的使用量[42]。曲霉與革蘭氏陽性放線菌（Actinomyces）、芽孢桿菌（Bacillus）等混合施用后，可以降低土壤中根腐病的發病率，增加細菌的多樣性，提高潛在有益細菌類群的相對豐度，降低潛在有害細菌的豐度，從而提高作物的產量和品質[43]。

1.4 未來發展方向

（1）多菌種聯合深入研究。由生物肥料的宏觀功能轉向微生物間信號交流、表達水平以及代謝機制。Du等[44]發現鏈霉菌（Streptomyces spp.）和慢生根瘤菌（Mesorhizobium spp.）之間代謝物介導的鐵競爭和共享形成了鄰里防御性互惠現象；此外，代謝組學與質譜聯用技術能夠鑒定促進植物形態建成的潛在化合物、激素含量以及根際微生物分泌的益生元等[45]。熒光定量技術可鑒定生長激素類基因等的表達水平。相信未來空間轉錄組學的發展，將進一步深化微生物表達的空間結構。

（2）施用方式多樣化。種衣劑包衣和液面噴施也可以達到增產效果。將種子在液體生物肥料煙曲鏈霉菌（Streptomyces fumanus）中浸泡，可以刺激種子和幼苗的生長，富集土壤氨化細菌[46]。從大豆植株中分離慢生根瘤菌（Bradyrhizbium spp.），以滅菌泥炭苔蘚作為載體，可以提高根瘤數量、干重、結莢數量等[47]。生物肥料與化學肥料還可以在基肥與葉面追肥階段輪換使用。

2 化學熏蒸劑與生物肥料聯合施用

評價化學熏蒸劑與生物肥料聯合施用效果的指標一般包括：土傳病原菌數量、土壤理化性質、土壤酶活性以及土壤微生物群落。化學熏蒸劑在一定程度上抑制了部分土壤酶的活性。威百畝熏蒸后，抑制了土壤脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶的活性；石灰氮熏蒸后，抑制了土壤脲酶和堿性磷酸酶的活性；棉隆熏蒸后，抑制了土壤脲酶的活性。隨著生物菌肥的施入，土壤酶活性逐漸恢復和提升[48]。

Cheng等[49]圍繞化學熏蒸劑1,3-D的土壤活化，開展了室內和室外試驗。1,3-D室內熏蒸后，添加枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum），孵育期收集土壤并檢測指標。熏蒸后添加生物肥料的土壤pH、電導率、土壤銨態氮、硝態氮、速效鉀和土壤有機質均有所提高；土壤中的脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性增強；有益細菌放線菌（Actinobacteria）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、假單胞菌屬、芽孢桿菌、溶桿菌屬（Lysobacter）的相對豐度增加顯著。田間試驗表明，添加生物肥料可進一步增強1,3-D對鐮刀菌屬和疫霉菌屬的抑制作用。土壤微生物的多樣性和鞘氨醇單胞菌、芽孢桿菌、被孢霉屬（Mortierella）、木霉等有益微生物的相對豐度在土壤生物活化后增加[50]。1,3-D熏蒸后，連續兩季添加哈茨木霉微生物菌劑、有機肥料或兩者混合施用，幾乎所有處理線蟲侵擾均顯著減少，三者結合線蟲抑制率最佳。該方法在綜合防治線蟲，減少化學品投入方面具有一定的意義[51]。

化學熏蒸劑棉隆熏蒸后添加復合生物肥料，微生物α多樣性指數能夠恢復到熏蒸前狀態[52]。Li等[53]研究了棉隆對土壤活化的影響。在作物生長期添加芽孢桿菌生物肥料，可以有效抑制土傳病原菌的數量，提高土壤中氨態氮的含量、過氧化氫酶活性，富集有益微生物如綠曲菌門（Chloroflexi）芽孢桿菌和馬杜拉放線菌（Actinomadura）等。同時，草莓產量與有益微生物的豐度正相關。Ge等[54]在棉隆熏蒸后施用有機肥，熏蒸處理顯著降低了微生物網絡的復雜性。隨著有機肥的添加，網絡結構逐漸復雜。Zhang等[55]在堆肥中添加拮抗細菌解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和真菌貴州木霉（Trichoderma guizhouense），用于改善棉隆熏蒸后的土壤微生物群落。在作物成熟期，芽孢桿菌富集并占據了微生物的關鍵網絡節點。通過深耕的方式，棉隆熏蒸后施加生物肥料，激活了土壤中過氧化氫酶、脲酶、蔗糖酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性，顯著提高了土壤中氮、磷、鉀水平，從而促進了菊花的生長[56]。

Pu等[57]開展了氯化苦土壤活化的研究。氯化苦熏蒸后，種植期施用富含芽孢桿菌和放線菌的生物有機肥和普通有機肥，分別提高了土壤N（9.88%和8.21%）、P（21.39%和11.57%）、K（7.99%和2.75%）質量分數和皂苷質量分數（23.62%和9.12%）。相對于常規有機肥，生物肥料增加了球囊菌門（Glomeromycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、腐質霉門（Humicola）和芽孢桿菌門的相對豐度，降低了子囊菌門（Ascomycota）和鐮刀菌門的豐度，生物有機肥料的促進效果優于普通有機肥。

碳酸氫銨和石灰作為新型熏蒸劑在抑制病害方面效果顯著[58]。碳酸氫銨能夠使發病率從96%降至40%。添加石灰，病害抑制率可提高12%。另外，添加生物有機肥料能夠將對病害的防治效果從7%提高到12%[59]。室內盆栽試驗結果表明，石灰和碳酸氫銨混合熏蒸后施用富含解淀粉芽孢桿菌的生物肥料，可使發病率降低80%[60]。這種熏蒸策略對病害的抑制可能歸因于土壤性質的改變以及土壤微生物區系的恢復。進一步研究抑制香蕉枯萎病的土壤微生物群響應機制，細菌群落首先對熏蒸做出回應，真菌群落率先對施肥做出反應[61]。熏蒸后施用生物肥料，土壤中富集到雙生單胞菌（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、假單胞菌屬、溶桿菌（Lysobacter）和芽孢桿菌等與病原菌如鐮刀菌豐度呈現負相關的根際有益細菌[62]。

二甲基二硫和氯化苦聯合熏蒸后噴施木霉，能夠顯著提高黃瓜產量（35.6%）和對土傳病原菌、根結線蟲的相對防效，增加了索氏真菌（Sodiomyces）和根霉屬（Rhizophlyctis）等有益微生物的相對豐度[63]。

化學熏蒸降低了根際微生物的多樣性，平衡了微生物群落組成的偏差，同時土壤理化性質也發生了顯著變化，降低了病害侵染率，促進了植物生長。與熏蒸處理相比，生物肥料對土壤和作物的影響中等，更多用于提前預防。相關分析表明，生物制劑主要是直接作用，而熏蒸對緩解作物連作障礙有間接作用，即重建土壤微生物群落，然后改變土壤性質和植株表現，從而有效地緩解連作障礙[64]。將兩者結合使用，可以彌補化學熏蒸劑持效期短、田間管理不當導致后期病原菌數量易增加等問題。

3 腐殖質活化技術

腐殖質（humus，HS）是由動植物殘體經物理、化學、微生物等分解和轉化而形成的黑棕色高分子有機物，主要包括腐植酸（humic acid，HA）、黃腐酸（fulvic acid，FA）和胡敏素（humin，HM）[65]。腐植酸以芳香環為核心，環上氫被醌基、酚基、羧基等官能團取代，酚基賦予腐植酸親水性，脂肪族鏈和芳香環賦予腐植酸親油性。大多數腐植酸可溶于堿性介質，部分溶于水，不溶于酸性介質[66]。天然腐植酸主要從風化煤、褐煤、草炭中提取[67]。人工腐植酸主要利用工、農業廢棄物通過發酵法與化學法制備[68]。腐植酸肥料以腐植酸為原料，通過氨化、絡合、復分解等一系列反應而制得。其對土壤結構的改良功能包括：提高土壤有機碳含量，釋放營養元素，提高肥料利用率，改善土壤孔隙結構，以及增強土壤通氣和保水能力。對作物的改善功能包括：刺激根系生長，增加側根數量，提高根系與土壤接觸面積和養分吸收能力，調節植物代謝，增強植株的抗逆性，提高作物產量，并改善作物品質[69]。對土壤重金屬的吸附功能包括：螯合土壤金屬離子形成絡合物，使微量元素向植株轉運，鈍化吸附土壤中的重金屬，減少土壤和水中殘留。對土壤酶和微生物的影響包括：降低土壤脲酶，減少氨的損失，提高土壤堿性磷酸酶和過氧化氫酶的活性，增強磷的有效性，增加根際土壤參與養分轉化微生物的數量。腐植酸具有用量少、成本低、吸收快等特點。

黃腐酸中氧含量較多而碳含量較少，較腐植酸具有更強的陽離子交換能力、螯合力以及吸附能力[70]。黃腐酸能夠改善土壤物理性質，提高葉綠素含量，增強光合作用，提高作物抗病抗旱能力。

胡敏素的聚合程度最高，不溶于酸堿性溶液，主要用于土壤重金屬污染修復[71]。

4 硅肥活化技術

硅是土壤中第二大元素，僅次于氧。也是繼N、P、K之后的第四大植物營養元素[72]，但土壤中的結晶態和不定型態硅無法被植物直接吸收。據報道，我國50%耕地缺硅，土壤中缺硅會干擾植株形態建成，造成作物減產[73]。硅肥主要包括熔渣硅肥、水溶性硅肥、硅復混肥、有機硅水溶緩釋肥等[74]。

硅肥對農作物的影響包括：提高根系活力，增加葉片厚度和葉綠素含量，促進光合作用；協調干物質轉運，積累營養物質，提高作物的產量和品質；吸收硅形成硅化細胞，增強抗倒伏能力；提高超氧化物歧化酶、多酚氧化酶和谷胱甘肽還原酶活性，增強植株的抗病性[75]；提高氧化還原酶、細胞大分子等代謝相關基因的表達，增強作物的抗旱性[76]。

硅肥對土壤重金屬的影響包括：鈍化土壤重金屬，促使重金屬由可交換態向更穩定的形態轉化[77]；誘導作物合成抗氧化相關物質并提高相關酶的活性，抑制作物對重金屬的吸收轉運，降低籽粒中重金屬的含量[78]。對土壤的改良功能包括：提高土壤有效硅含量，調節土壤酸堿度，提高土壤通透性，促進養分循環，減少甲烷排放，增加腐生真菌數量，促進有機質的礦化。

5 生物炭活化技術

生物炭（biochar）是生物殘體在缺氧條件下經高溫熱解形成的一類富碳、難溶、高度芳香化的固體顆粒材料[79]。由于熱解過程未破壞孔隙結構，使生物炭保留了較大的比表面積，施用到土壤后能夠減小土壤的容重，增加其透氣性及持水和蓄肥能力，提高肥料的利用率。活性炭表面羧基等含氧官能團釋放鹽基離子，可提高土壤陽離子的交換量，同時官能團與土壤中重金屬離子發生絡合反應，減少了土壤中重金屬的遷移[80]。生物炭富含碳（70%以上），全碳組分受生物質原料的來源、種類、粒徑，熱解過程的溫度、壓力、升溫速度和停留時間等因素的影響[81]。生物炭施用后增大了土壤碳氮比，增加了碳庫儲備，提高了土壤有機質的含量。

生物炭能夠提高土壤養分供給。在固氮作用和硝化作用中，通過提高土壤固氮微生物、硝化微生物和反硝化微生物的群落結構及活性，增加土壤無機氮含量，減少N2O排放[82]。生物炭可通過炭化過程釋放磷酸鹽，促進磷酸根溶解；提高土壤pH，抑制可溶性磷與金屬離子的絡合；為解磷微生物提供碳源等多種途徑增加土壤中有效磷含量[83]。生物炭直接供給鉀，或改善土壤溫度、水分、減少淋溶等間接因素，提高土壤中速效鉀含量。

生物炭可以促進有益微生物的生長，增加微生物的豐度，改善土壤微生物的結構，提高土壤酶的活力[84]。生物炭一方面分解營養物質，為微生物提供碳源；另一方面，通過改善土壤理化性質，為微生物定殖創造空間。連續多年施用生物炭提高了與C-N-P-S循環相關的土壤微生物功能類群的豐度及農業生態系統的多功能性[85]。生物炭對土壤表面的改良減少了熏蒸劑的排放，提高了土壤微生物的恢復速度[86]。生物炭用于土壤改良與調節微生物群落結構，具有廣闊的應用前景。

6 結語

生物肥料在減少化肥使用量、提高作物產量、改善產品質量方面，具有廣闊的應用空間，但是目前生物肥料的發展仍面臨一些挑戰，如選定合理待開發菌株的生物制約、保質期的技術限制、產品注冊的嚴格監管約束等[87]。同時，生物肥料的田間效果受植物品種、生長發育階段、微生物群落、土壤類型、組成以及土壤管理措施等生物因素和非生物因素的制約。

一方面，腐植酸提取工藝的不統一，造成各種腐植酸肥料的原料質量不同，需要借助先進的檢測技術對腐植酸的基本結構進行鑒定，建立統一的評價體系。另一方面，人們對腐植酸促進植物生長機理的認識不夠系統和深入，需要重點研究植物、土壤性狀和微生物等影響因子對腐植酸功能的介導作用[88]。

高昂的生產成本造成我國目前僅登記58件含硅水溶肥，未來需要開發生產成本低廉的硅肥生產工藝[89]。目前對硅肥作用機理的研究大多還停留在物理屏障和生化生理方面。未來應重點對硅肥增效的分子機制進行研究。同位素標記法研究硅與其他營養元素的互作和在植株體內的循環轉化；轉錄組學和代謝組學探究植株和土壤微生物對硅肥施用后基因表達情況及代謝化合物通路的鑒定。

目前，生物炭的推廣因其性質和特征缺乏系統研究且田間研究周期較短而受到限制。生物炭對土壤改良效果顯著，但改良效果受土壤類型，生物炭種類、添加量、與其他改良劑的混合比例等多種因素的影響[90]。未來，應深入研究生物炭的負面影響，如微生物分解生物炭過程中潛在的二氧化碳排放問題；生物炭灰分造成的土壤堿性對土壤有益微生物生長的干擾；自身吸附的重金屬對環境的負面影響等，為生物炭的合理使用提供指導。

綜上所述，土壤活化技術應根據實際土壤類型進行定量與定性使用。如化學熏蒸劑與微生物菌劑聯合使用，可以提高土壤微生物的活性；化學熏蒸劑與生物有機肥聯合使用，可以提高土壤有機質含量；化學熏蒸劑與生物炭聯合使用，可以改良南方酸性黏結土壤；化學熏蒸劑熏蒸后，應在作物生長期液面噴施腐植酸和硅肥；微生物菌劑與腐植酸、硅肥以及生物炭等混合，可以減少化學熏蒸劑的使用。以上措施均能夠有效抑制土傳病害，改善土壤結構，促進土壤微生物的多樣性，在一定程度上活化土壤，緩解連作障礙。