槐耳多糖調(diào)節(jié)SPHK1/S1P/S1PR3信號通路對宮頸癌細胞惡性生物學行為的影響

李麗品, 馬素艷, 安入征

(河北省石家莊市平安醫(yī)院腫瘤科, 河北 石家莊 050000)

宮頸癌是婦女最常見的癌癥之一,其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中排名第四。由于其持續(xù)耐藥和反復復發(fā),患者預后較差[1]。因此尋求新的治療藥物對宮頸癌的治療至關重要。近年來,中草藥在癌癥治療中被廣泛研究,槐耳(Trametes robiniophila Murr)作為一種傳統(tǒng)中草藥被廣泛應用于許多疾病,近年來,槐耳被廣泛應用于抗腫瘤藥物的研究,槐耳多糖(Huaier polysaccharide,HP)是槐耳提取物,可增強機體免疫、抗氧化、抗炎反應,其在胃癌、乳腺癌等多種癌癥中可促進細胞凋亡,表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用[2],但其在宮頸癌中抗癌作用及機制尚不清楚。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是鞘脂代謝的中心分子,決定細胞的命運,由鞘脂苷通過兩種酶(鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPHK1),鞘氨醇激酶2(sphingosine kinase 2,SPHK2)產(chǎn)生,S1P與5種G蛋白偶聯(lián)受體(S1PR1-5s)結(jié)合,在調(diào)節(jié)細胞存活、遷移等過程中起著至關重要的作用[3]。研究顯示SPHK-S1P-S1PRs信號通路在細胞增殖生長中發(fā)揮作用,SPHK1的過度激活可能促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。宮頸癌中SPHK1高表達,沉默SPHK1宮頸癌細胞細胞活性、增殖能力顯著降低,細胞凋亡率顯著升高。槐耳多糖影響宮頸癌發(fā)生機制是否與SPHK1/S1P/S1PR3信號通路有關尚不清楚。本研究基于SPHK1/S1P/S1PR3信號通路,探究槐耳多糖對宮頸癌細胞惡性生物學行為的影響及機制,為宮頸癌治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料:人宮頸癌細胞HeLa(CL-0101)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;槐耳多糖(Huaier polysaccharide,HP)(S28138)購自上海源葉生物科技有限公司;SPHK1激活劑K6PC-5(E1218)購自Selleck公司;RPMI 1640培養(yǎng)基(11875176)購自賽默飛公司;MTT試劑盒(CT0002)購自山東思科捷生物技術有限公司;Edu細胞增殖試劑盒(E-CK-A377)購自武漢伊萊瑞特公司;一抗Snail(A5243)、N-cadherin(A3045)、E-cadherin(A3044)、SPHK1(A0139)、S1PR3(A1404)、GAPDH(AC001)購自ABclonal公司;一抗S1P(ab59870)及二抗山羊抗兔IgG(ab205718)購自Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng)及MTT檢測細胞活力:HeLa細胞于RPMI 1640培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清)中培養(yǎng)(37℃,5% CO2),并進行消化傳代,當細胞合流度達到90%時,進行實驗。細胞接種于96孔板。孵育過夜后,用不同濃度(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)的槐耳多糖溶液替換培養(yǎng)基,24、48和72h后加入MTT溶液,孵育4h。隨后,每孔中的溶液小心用DMSO替換10min。在酶標儀中490nm波長下讀取吸光度值,并計算細胞活力。

1.2.2分組及處理:將對數(shù)生長期細胞分為對照組(Control組)、槐耳多糖低、中、高濃度組(HP-L、HP-M、HP-H組)和槐耳多糖高濃度+SPHK1激活劑K6PC-5組(HP-H+K6PC-5組)。HP-L、HP-M、HP-H組分別使用50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL槐耳多糖溶液處理細胞24h,HP-H+K6PC-5組使用200μg/mL槐耳多糖溶液和10μM的K6PC-5共處理細胞24h。

1.2.3Edu檢測細胞增殖:按照1.2.2中的分組處理細胞,并接種于96孔板(4.0×104/孔)培養(yǎng)24h,去除培養(yǎng)基后,用Edu處理2h。丟棄含有Edu的培養(yǎng)基后,用4%甲醛和0.5% Triton X-100溶液固定細胞透化細胞,DAPI對細胞核進行染色,熒光顯微鏡下觀察Edu陽性細胞數(shù),并計算Edu陽性細胞率。

1.2.4細胞遷移和侵襲能力檢測:將各組細胞接種于24孔板中,當細胞達到約90%匯合時,用移液管吸頭刮擦細胞單層以形成均勻劃痕,用無血清磷酸鹽緩沖液沖洗后將在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。光學顯微鏡下拍照觀察0h和24h劃痕的融合情況,并計算細胞劃痕愈合率。使用24孔Transwell裝置進行體外侵襲試驗,上腔接種各組細胞(1×104/mL),下腔為10%胎牛血清的培養(yǎng)基。1d后,通過多聚甲醛和結(jié)晶紫對下室的侵襲的細胞進行固定、染色,光學顯微鏡拍照觀察,并計算侵襲細胞數(shù)量。

1.2.5Western blot檢測蛋白水平:收集處理后的細胞,裂解緩沖液中裂解。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后,與一抗SPHK1、S1P、S1PR3、Snail、N-cadherin、E-cadherin及GAPDH過夜孵育(4℃)。后與相應二抗孵育1h(室溫)。ECL進行顯影,Image J計算蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1槐耳多糖對宮頸癌細胞活力的影響:不同濃度HP處理宮頸癌細胞24、48、72h后,細胞活力逐漸降低,除25μg/mL處理濃度外,其與各濃度處理的細胞活力顯著降低(P<0.05)。為保證一定存活率,選擇50、100、200μg/mL的HP用于后續(xù)研究。見圖1。

圖1 槐耳多糖對宮頸癌細胞活力的影響

2.2槐耳多糖對宮頸癌細胞增殖的影響:與Control組比較,HP-L組、HP-M組和HP-H組細胞Edu陽性率依次降低(P<0.05)。與HP-H組比較,HP-H+K6PC-5組細胞Edu陽性率顯著升高(P<0.05),見圖2、3。

圖2 Edu檢測各組細胞增殖情況(×200)

圖3 槐耳多糖對宮頸癌細胞增殖的影響

2.3槐耳多糖對宮頸癌細胞遷移和侵襲的影響:與Control組比較,HP-L組、HP-M組和HP-H組細胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率依次降低(P<0.05)。與HP-H組比較,HP-H+K6PC-5組細胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率顯著升高(P<0.05),見圖4、圖5、圖6。

圖4 劃痕愈合實驗檢測各組細胞遷移能力

圖5 Transwell小室實驗檢測各組細胞侵襲能力(×200)

圖6 槐耳多糖對宮頸癌細胞遷移和侵襲的影響

2.4槐耳多糖對宮頸癌細胞E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白水平的影響:與Control組比較,HP-L組、HP-M組和HP-H組E-cadherin水平依次升高,N-cadherin、Snail水平依次降低(P<0.05)。與HP-H組比較,HP-H+K6PC-5組E-cadherin水平顯著降低,N-cadherin、Snail水平顯著升高(P<0.05),見圖7、8。

圖7 Western blot檢測各組細胞EMT相關蛋白水平

圖8 槐耳多糖對宮頸癌細胞E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白水平的影響

2.5槐耳多糖對宮頸癌細胞SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平的影響:與Control組比較,HP-L組、HP-M組和HP-H組SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平依次降低(P<0.05)。與HP-H組比較,HP-H+K6PC-5組SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平顯著升高(P<0.05),見圖9、10。

圖9 Western blot檢測通路相關蛋白水平

圖10 槐耳多糖對宮頸癌細胞SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平的影響

3 討 論

宮頸癌是全世界婦女癌癥死亡的第四大原因,由于其高發(fā)病率和死亡率,對有效的診斷、治療和預防藥物的需求未得到滿足,雖然放療和化療等方式在宮頸癌上取得了較好的治療效果,但耐藥性的產(chǎn)生使患者預后較差[6]。

槐耳多糖是一種由6個單糖和18個氨基酸組成的活性成分,是中草藥槐耳的主要提取物,對癌細胞具有抑制作用[7]。本研究結(jié)果顯示槐耳多糖處理HeLa細胞后,細胞活力、增殖能力均降低,與前人研究結(jié)果相似[8]。表明槐耳多糖具有抑癌作用,可降低宮頸癌細胞活力,抑制其增殖。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在癌癥的進展、侵襲、遷移中起著關鍵作用,上皮細胞通過失去細胞極性和上皮標記物(E-cadherin)的表達發(fā)生表型轉(zhuǎn)換,通過獲得間充質(zhì)標記物(N-cadherin,Snail)的表達成為間充質(zhì)細胞,表現(xiàn)出細胞間粘連減少和運動性增加,因此E-鈣粘蛋白的丟失,是EMT過渡過程中的關鍵步驟[9]。有研究表明槐耳多糖可通過抑制EMT抑制癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[10]。本研究中槐耳多糖處理后HeLa細胞N-cadherin、Snail水平降低,E-cadherin蛋白上調(diào),其遷移及侵襲能力受到抑制,與雷蕾等研究結(jié)果相似[11]。表明槐耳多糖可能通過抑制EMT進展抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移。

據(jù)報道SPHK1/S1P/S1RP3信號通路在癌細胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成中起重要作用[12]。有研究表明SPHK1在大多數(shù)癌癥中普遍表達,SPHK1的過度激活促進了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,SPHK1是S1P合成的主要酶,控制著S1P的水平,在癌細胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤血管生成中起重要作用[13]。Zhang[14]等研究表明SPHK1/2的過度表達和/或過度激活在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用,通過抑制SPHK表達能抑制細胞活力、集落形成、增殖、遷移及細胞周期進展。本研究中細胞SPHK1、S1P、S1PR3水平隨著槐耳多糖濃度的增加依次降低,同時其增殖、遷移、侵襲能力受到抑制。而激活劑K6PC-5逆轉(zhuǎn)了槐耳多糖對細胞增殖、侵襲、遷移及SPHK1/S1P/S1RP3信號通路的抑制作用。表明槐耳多糖能抑制宮頸癌細胞惡性生物學行為的發(fā)生,其機制可能與抑制SPHK1/S1P/S1RP3信號通路傳導有關。

綜上所述,槐耳多糖對宮頸癌細胞有顯著抑制作用,其作用機制可能與抑制SPHK1/S1P/S1RP3信號通路傳導有關。本文初步探究了槐耳多糖對宮頸癌細胞的影響,其機制復雜,且本研究未在體內(nèi)進行驗證,今后仍需進行深入研究并在體內(nèi)進行驗證,為槐耳多糖在宮頸癌的治療應用上提供參考。