高脂肪飲食促進TLR2的表達促進3T3L1脂肪細胞分泌IFN-γ誘導胰島素抵抗的發(fā)生及發(fā)展

白繼昌, 談力欣, 劉贊朝, 楊 洋, 朱亞軍

(1.河北省石家莊市第二醫(yī)院, 河北 石家莊 050000 2.河北省人民醫(yī)院內分泌科, 河北 石家莊 050000)

脂肪細胞通過調節(jié)細胞因子分泌在脂肪和葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用。脂肪細胞中細胞因子分泌調節(jié)的紊亂被認為是代謝綜合征的發(fā)病機制[1]。此外,內臟區(qū)域脂肪細胞的過度積累與腫瘤壞死因子α ( tumor necrosis factor a,TNF-α )的表達升高有關。與內臟脂肪堆積相關的脂肪細胞對細胞因子產生的異常調節(jié)似乎導致了代謝綜合征中的血脂紊亂、高血壓和葡萄糖不耐受。脂肪細胞的大小根據代謝條件而變化。這種特征實際上似乎是肥胖和代謝綜合征發(fā)病機制的一個因素。這些細胞大小的變化伴隨著甘油三酯合成、游離脂肪酸(FFA)產生和細胞因子產生的變化。較大的脂肪細胞傾向于分泌細胞因子IFN-γ和抵抗素,較小的脂肪細胞分泌脂聯素[2]。因此,脂肪細胞的大小似乎是脂肪組織中細胞因子產生類型的組織學標志。研究表明,內臟脂肪的堆積而非皮下脂肪的堆積,是由于堆積的脂肪細胞分泌TNF-α增多而引起系統性胰島素抵抗[3]。IFN-γ通過激活JAK/STAT途徑減弱人類脂肪細胞中的胰島素信號傳導、脂質儲存和分化[4]。因此,脂肪細胞根據脂肪組織的積聚位置調節(jié)細胞因子的產生,脂肪細胞的功能變化隨后導致胰島素抵抗。基因芯片分析發(fā)現,內臟區(qū)域聚集的脂肪細胞表達多種基因,尤其是蛋白酶基因家族,導致胰島素抵抗的發(fā)生[5]。因此,了解積聚在內臟區(qū)域的脂肪細胞功能變化的潛在機制,了解分泌IFN-γ和其他細胞因子的細胞的特征是十分重要的。本研究的目的是確定哪些類型的脂肪細胞表達IFN-γ,并闡明內臟脂肪細胞功能變化與高脂肪攝入有關的機制。

1 材料與方法

1.1從小鼠脂肪組織中分離脂肪細胞:從8周齡開始,給予雄性C57 BL/6 J小鼠(Charles River,MA)正常飲食或含有20%蛋白質、20%碳水化合物和60%脂肪的高脂肪飲食(Research Diet,New Brunswick,NJ)。14d后處死兩組小鼠,此時對照組平均體重為25.1g,高脂喂養(yǎng)組平均體重為28.3g。取附睪、腸系膜或皮下脂肪組織,稱重,用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗,切碎,在含有4%牛血清白蛋白(BSA)和1mg/mL I型膠原酶(NITTA GELATIN,Osaka,日本)的Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中37℃消化60min。將消化的組織通過250μm尼龍網過濾以去除未消化的組織,并以400rpm離心4min。洗滌漂浮的脂肪細胞部分,并用70μm尼龍過濾器將大脂肪細胞與小脂肪細胞分離。

1.2細胞培養(yǎng):3T3-L1細胞(American Type Culture Collection,美國)維持在含有25mM葡萄糖(DMEM-H)培養(yǎng)基(Sigma Chemicals,St.Louis,MO)的DMEM中,該培養(yǎng)基補充有10%胎牛血清(Gemini Bio Products,美國)和慶大霉素硫酸鹽(Schering-Plough,美國),溫度為37℃,濕度為5%CO2/95%空氣。3T3-L1脂肪細胞參照前面描述的方法分化。

1.3酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA):將缺乏血清的3T3-L1脂肪細胞與由肉豆蔻酸鹽和棕櫚酸鹽組成的FFAs混合物(Sigma Chemicals)或500μM Zymosan A(Wako Chemicals,Osaka,Japan)孵育,并根據制造商的說明書(BioLegend,美國)對培養(yǎng)基中的小鼠TNF-a進行測定。

1.4使用定量實時逆轉錄聚合酶鏈式反應(quantitative real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction ,RT-PCR)測量mRNA水平: 用ISOGEN(Nippon gene,日本)從附睪脂肪組織分離的脂肪細胞或3T3-L1脂肪細胞中分離總RNA。小鼠TLR2和TNF-a mRNA表達水平通過定量實時RT-PCR測定,基本上如前所述[6]。

1.5流式細胞儀分析:從脂肪組織中分離的脂肪細胞( 1×106個細胞)用4 %多聚甲醛固定,PBS洗滌。將固定的脂肪細胞與2μg鼠Toll樣受體2 ( toll-like receptor 2,TLR2 )單克隆抗體偶聯的藻紅蛋白( PE ) ( e-bioscience,美國)在Hanks平衡鹽溶液( HBSS )中室溫避光孵育60min。然后將小鼠TNF-α多克隆抗體(Rockland Immunochemicals,美國)偶聯異硫氰酸熒光素( FITC )與含有0.1 %皂甙( Wako chemicals,日本)的HBSS在室溫下避光孵育脂肪細胞60min。細胞用PBS洗滌3次,用FACS流式細胞儀流式細胞儀( Becton-Dickinson )分析。使用與正常IgG綴合的PE或FITC孵育的細胞作為陰性對照。

1.6TLR2的siRNA敲除:用5nmoL TLR2 siRNA或Allstars陰性對照siRNA(Qiagen,德國)通過電穿孔轉染3T3-L1脂肪細胞。處理后的細胞立即在37℃,濕度為5%CO2/95%空氣。然后對細胞進處理。

1.7蘇木精-伊紅染色和免疫組化分析:石蠟包埋后,切片(4μm厚度)用蘇木精-伊紅染色。使用ImageJ軟件計算胰島的大小。用抗TLR2和IFN-γ的特異性抗體(Santa Cruz,美國)進行免疫組織化學染色,以檢測脂肪組織中的炎癥因子和胰島素途徑蛋白表達。使用鏈霉親和素過氧化物酶組織染色SP試劑盒檢測抗體反應性。免疫組化陽性染色定義為黃棕色。

1.8統計分析:本研究的數據以平均值±SE的形式表示。均值之間差異的顯著性通過使用Statistica軟件(Tulsa,OK)的單向或雙向方差分析和不平衡設計的Tukey檢驗進行評估,或通過使用Statview軟件(Abacus Concepts,Berkeley)的雙尾不配對Student t檢驗進行評估。P<0.05被認為是具有顯著性差異。

2 結 果

2.1高脂攝入小鼠附睪脂肪中脂肪細胞IFN-γ的表達與脂肪細胞肥大:為了解 IFN-γ基因表達與脂肪細胞肥大的關系,分析了高糖攝入對小鼠脂肪組織中 IFN-γ表達的影響。喂食高脂飲食2周的小鼠和喂食正常飲食的小鼠在口服葡萄糖負荷后血糖水平沒有顯著差異。胰島素耐受試驗表明,與對照組小鼠相比,喂食高脂肪飲食的小鼠胰島素敏感性降低。(胰島素負荷后30min,血糖水平分別為147.7±30.9mg/dL 和43.3±32.0mg/dL。)與正常組相比,高脂飲食組小鼠附睪脂肪組織中 IFN-γ mRNA 表達水平顯著升高(圖1A)。為了確定脂肪細胞中IFN-γ mRNA表達與其大小的關系,我們使用膠原酶處理,然后用2%四氧化鋨固定,測量了從附睪脂肪墊分離的脂肪細胞的直徑。喂食高糖的小鼠中的大脂肪細胞數量高于喂食正常飲食的小鼠(圖1B)。我們通過尼龍網篩過濾將分離的漂浮脂肪細胞分為兩組。小脂肪細胞被定義為直徑<70μm,而大脂肪細胞則被定義為具有>70μm的直徑。在喂食高脂肪飲食的小鼠中,兩組細胞中的IFN-γ mRNA表達水平均增加(圖1C)。一個值得注意的發(fā)現是,高脂肪攝入在較大脂肪細胞中的影響比在較小脂肪細胞中更明顯。這些結果表明,高糖攝入誘導脂肪細胞,特別是大脂肪細胞中IFN-γ的表達。

圖1 附睪脂肪組織和脂肪細胞的細胞大小和IFN-γ mRNA表達。從正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)2周的小鼠中分離附睪脂肪組織。

2.2高脂肪飲食小鼠和正常飲食的小鼠在大脂肪細胞中基因表達譜的比較:為了闡明高脂肪攝入誘導分離脂肪細胞中IFN-γ表達的機制,我們使用微陣列分析了高脂肪飲食小鼠和正常飲食小鼠的大脂肪細胞的基因表達譜。對喂食高脂肪飲食的小鼠脂肪細胞中表達顯著增加的560個基因進行了進一步分析(圖2)。在這些基因中,我們關注TLR2基因,因為它對免疫細胞中IFN-γ mRNA表達的影響[9]。為了確定TLR2表達對分離的脂肪細胞中IFN-γ表達的影響,我們使用流式細胞術來檢測表達TLR2或IFN-γ的脂肪細胞的數量。在喂食正常飲食的小鼠的附睪脂肪組織中檢測到表達TLR2的脂肪細胞。我們還觀察到,在喂食高脂肪飲食的小鼠中,脂肪細胞的數量急劇增加(圖3A)。在高脂肪攝入的小鼠中,表達IFN-γ的細胞數量也顯著增加(圖3B)。因此,我們試圖確定表達TLR2的細胞是否也表達IFN-γ。流式細胞術分析清楚地檢測到在所有小鼠中存在TLR2/IFN-γ共表達的脂肪細胞;然而,在高脂肪攝入的小鼠中,這些雙陽性脂肪細胞的數量急劇增加(圖3C-E)。因此,我們確定了TLR2和IFN-γ共表達的脂肪細胞的數量在小鼠中通過高脂肪攝入而增加。

圖2 正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)小鼠脂肪細胞中的差異表達基因

圖3 流式細胞術分析正常或高脂飲食小鼠附睪脂肪組織中表達TLR2 / IFN-γ的脂肪細胞。

從正常或高脂飲食喂養(yǎng)2周的小鼠中收集附睪脂肪組織,隨后分離脂肪細胞。脂肪細胞用4 %多聚甲醛固定,用PE標記的抗小鼠TLR2抗體( FL2-H )和抗小鼠TIFN-γ抗體孵育,然后用FITC標記的二抗( FL1-H )染色。從附睪脂肪組織制備的脂肪細胞暴露于PE偶聯的抗小鼠TLR2抗體( A )或抗小鼠INF-γ抗體,然后用FITC連接的二抗染色( B )。(C)將從喂食高脂肪飲食的小鼠制備的脂肪細胞暴露于PE綴合的抗兔正常IgG,然后用FITC連接的第二抗體染色作為陰性對照。來自喂食正常飲食(D)或高脂肪飲食(E)的小鼠的脂肪細胞暴露于PE綴合的抗小鼠TLR2抗體和抗小鼠IFN-γ抗體,然后用FITC連接的二抗體染色。

2.3TLR2/IFN-γ陽性脂肪細胞主要存在于內臟脂肪組織中:我們還檢測了不同類型脂肪組織中TLR2/IFN-γ陽性脂肪細胞的比例(表1)。在附睪和腸系膜脂肪組織中,TLR2 / IFN-γ陽性脂肪細胞的比例分別為脂肪細胞總數的7.0 %和7.7 %。皮下脂肪中TLR2/ IFN-γ陽性脂肪細胞的比例較低(2.0%)。高脂肪飲食使附睪和腸系膜脂肪中TLR2/ IFN-γ陽性脂肪細胞分別增加到26.9%和18.5%。但皮下脂肪( 1.2 % )中雙陽性脂肪細胞比例無明顯變化。這些結果表明,TLR2 / IFN-γ陽性脂肪細胞主要存在于內臟脂肪中,其數量隨著高脂攝入而增加。

表1 在正常飲食和高脂飲食小鼠的不同脂肪組織中共表達TLR2和IFN-γ的脂肪細胞的數量

2.4高脂肪飲食對小鼠胰腺功能及炎癥反應的影響:H&E結果顯示,與正常飲食小鼠相比,高脂飲食組小鼠的胰島大小和空泡化有代償性增加(圖4A)。與正常飲食小鼠相比,高脂飲食誘導小鼠的胰島面積顯著增加(圖4B)。免疫組織化學結果顯示,與正常飲食小鼠相比,高脂飲食小鼠脂肪組織中TLR2和 IFN-γ的表達顯著提高(圖4C-D)。

圖4 高脂肪飲食對小鼠胰腺功能及炎癥反應的影響

2.5FFAs誘導TLR2 mRNA表達,TLR2激動劑誘導3T3-L1脂肪細胞分泌IFN-γ:與喂食正常飲食的小鼠相比,喂食高脂肪飲食的小鼠的血漿FFA水平增加(圖5A)。為了確定TLR2表達是否有助于脂肪細胞中IFN-γ的表達,我們檢測了FFA水平對3T3-L1脂肪細胞中TLR2表達與IFN-γ表達的影響。用棕櫚酸鹽和肉豆蔻酸鹽的混合物處理以時間依賴的方式誘導3T3-L1脂肪細胞中TLR2 mRNA的表達(圖5B)。用已知的TLR2激活劑Zymosan A處理也誘導3T3-L1脂肪細胞分泌IFN-γ(圖5C)。為了分析TLR2表達對FFA誘導的IFN-γ表達的影響,我們通過用TLR2特異性siRNA預處理3T3L1脂肪細胞來敲低TLR2途徑。在用對照siRNA轉染的3T3-L1脂肪細胞中,FFAs誘導IFN-γ mRNA表達增加三倍。用TLR2特異性siRNA處理使FFA誘導的IFN-γ mRNA表達水平降低40%(圖5D)。因此,我們得出結論,TLR2的表達通過培養(yǎng)的脂肪細胞中的受體激活引起IFN-γ的表達。

圖5 FFA誘導3T3-L1脂肪細胞中TLR2和IFN-γ的表達

3 討 論

本研究的目的是了解小鼠脂肪細胞在高脂肪攝入導致胰島素抵抗過程中的表型變化。本研究進行了微陣列分析,以全面比較喂食高脂肪飲食或正常飲食的小鼠中脂肪細胞的基因表達模式。本研究結果表明,TLR2和IFN-γ基因在高脂飲食的小鼠脂肪細胞中高度表達。流式細胞術分析鑒定出一組同時表達TLR2和IFN-γ蛋白的脂肪細胞。在喂食高脂肪飲食的小鼠中,共表達TLR2和IFN-γ的脂肪細胞的數量顯著增加。附睪和腸系膜脂肪組織中共表達TLR2和IFN-γ的脂肪細胞數量也顯著高于皮下脂肪組織。在3T3-L1脂肪細胞中,FFA(棕櫚酸鹽和肉豆蔻酸鹽的混合物)誘導TLR2和IFN-γ mRNA表達,而TLR2特異性siRNA抑制FFA誘導的IFN-γ mRNA的表達。

脂肪細胞分泌多種細胞因子,參與調節(jié)葡萄糖和脂質穩(wěn)態(tài)。肥胖個體的脂肪細胞表現出分泌功能的改變,從而導致更高水平的細胞因子或促炎分子(包括TNFa、白細胞介素-6、血管緊張素原和抵抗素)的釋放[7-8]。此外, Wada T等研究指出,Ⅰ型和Ⅱ型IFN通過誘導不同的SOCS亞型誘導胰島素抵抗,IL-6通過增強STAT3介導的3T3-L1脂肪細胞中SOCS3的誘導而協同增強IFN-γ誘導的胰島素抵抗[9]。因此,我們重點研究了高脂肪攝入和脂肪細胞中IFN-γ表達之間的關系,以闡明IFN-γ在積聚的內臟脂肪組織中表與喂食正常飲食的小鼠相比,喂食高脂肪飲食的小鼠中的大脂肪細胞和小脂肪細胞都表達更高水平的IFN-γ mRNA。先前已經表明,脂肪細胞肥大與胰島素抵抗有關[10]。然而,脂肪細胞中TNFa基因的表達與胰島素信號傳導受損有關,而與脂肪細胞大小無關[11]。我們的研究結果表明,IFN-γ的表達在很大程度上取決于高脂肪攝入以及脂肪細胞肥大。微陣列分析表明,高脂肪飲食改變了大脂肪細胞中的各種基因。達誘導背后的機制。

除了IFN-γ表達外,喂食高脂肪飲食的小鼠的脂肪細胞中TLR2基因表達水平顯著增加。由于TLRs在固有免疫和適應性免疫中的重要作用,其功能主要在免疫細胞中進行研究[12-13]。最近的研究表明,TLR2基因多態(tài)性的不同頻率與胰島素抵抗及其相關疾病的高風險顯著相關[14]。這些觀察結果以及我們的觀察結果表明,脂肪組織中TLR2的表達可能與人類的胰島素抵抗有關。棕櫚酸酯是一種飽和脂肪酸,可激活TLR2并誘導促炎途徑,導致肌管中的胰島素抵抗[15]。在本研究中,發(fā)現FFA刺激顯著增加了3T3-L1脂肪細胞中TLR2和IFN-γ mRNA的表達水平,并且脂肪細胞中的TLR2表達的敲低未能通過FFA增加IFN-γ基因的表達。因此,脂肪細胞中的TLR2信號被認為是由FFA激活的。健康受試者的FFA升高會短暫誘導胰島素抵抗,肌肉細胞中的FFA暴露會通過NF-κB和蛋白激酶Cs激活炎癥途徑[16]。FFA水平的升高也可能激活脂肪細胞中的炎癥途徑,TLR2似乎通過誘導IFN-γ的產生來促進該途徑。

在本研究中,初步鑒定了內臟脂肪組織中共表達IFN-γ和TLR2的脂肪細胞,并且脂肪細胞的數量因高脂肪攝入而增加。共表達IFN-γ和TLR2的脂肪細胞可能是脂肪組織中的“病理”細胞,參與代謝綜合征中胰島素抵抗的發(fā)展。細胞的進一步表征將提供關于脂肪細胞在胰島素抵抗發(fā)病機制中的作用的重要信息。