丁苯酞對(duì)小鼠顱腦損傷后認(rèn)知功能的保護(hù)作用

牛文書,張振紅,王玉斌,李經(jīng)綸,劉揚(yáng)

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院,1.神經(jīng)內(nèi)科;2.神經(jīng)外科,河南 鄭州 450000)

外傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)會(huì)造成感覺、認(rèn)知、行為、運(yùn)動(dòng)等功能損害,是45歲以下人群致死、致殘的重要病因之一[1]。TBI后神經(jīng)功能障礙可由直接和間接的機(jī)械損傷及合并的腦出血、缺血、水腫引起,也可由繼發(fā)的生化和病理生理層面的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起[2-3]。除手術(shù)、康復(fù)鍛煉外,有效的腦保護(hù)藥物也是治療顱腦損傷的策略之一。丁苯酞是我國自主研發(fā)的腦血管領(lǐng)域新藥,具有抗炎、抗氧化、減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等作用[4]。丁苯酞目前已被證實(shí)可改善大腦認(rèn)知功能,在急性腦梗死、血管性癡呆等疾病中顯示了良好的臨床效果[5]。有研究[6]報(bào)道丁苯酞能改善TBI小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分,但目前對(duì)丁苯酞在TBI后認(rèn)知障礙的應(yīng)用報(bào)道較少。基于此,本研究擬通過構(gòu)建小鼠急性TBI模型,旨在初步探討丁苯酞對(duì)腦外傷后認(rèn)知障礙的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性昆明小鼠40只,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,7～8周齡,體重(27±2.1)g。飼養(yǎng)條件:光照時(shí)間12 h,室溫20～22 ℃,濕度50%～60%,給予充足無菌水及飼料喂養(yǎng),適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

丁苯酞氯化鈉注射液(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司);抗小鼠腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)抗體(美國Abcam);抗小鼠GAPDH抗體(美國Abcam);BCA試劑盒(上海碧云天),TUNEL反應(yīng)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);DP71型熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社);成像系統(tǒng)(加拿大QImaging公司),Morris水迷宮系統(tǒng)(北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BioRAD)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備及分組 將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞處理組1和組2,每組各10只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞處理組1和組2采用壓縮損傷法誘導(dǎo)顱腦損傷。小鼠經(jīng)0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于鼠板上,備皮消毒,沿顱中線切開頭皮并暴露頂骨,在左頂部用牙科鉆研磨一直徑約為4 mm的骨窗,僅保留薄層顱骨。將小鼠固定于腦立體定位儀上,腦立體定位儀縱軸連接一鈍端直徑為3 mm的無菌損傷器械,以前囟后1.8 mm、中線旁2 mm為中心,緩慢旋轉(zhuǎn)腦立體定位儀縱軸,使骨面與損傷器械鈍端接觸后向下按壓1.3 mm,導(dǎo)致顱骨向內(nèi)塌陷壓縮腦組織。打擊結(jié)束后清潔創(chuàng)面,用骨蠟封閉骨窗,逐層縫合頭皮,放回鼠籠。假手術(shù)組僅磨薄顱骨,不造成腦壓縮損傷,其余步驟一致。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 以腹腔注射給藥對(duì)小鼠進(jìn)行干預(yù)。假手術(shù)組給予200 mg·kg-1·d-1丁苯酞處理;丁苯酞處理組1和組2分別給予100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1丁苯酞處理;手術(shù)對(duì)照組給予同等劑量生理鹽水處理。自開始造模前1 d每日固定時(shí)間給藥,連續(xù)給藥15 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)行為學(xué) (1)Y型迷宮測(cè)試。于建模后7 d、14 d以Y型迷宮自發(fā)輪替行為測(cè)試。Y型迷宮由3個(gè)不透光等長(zhǎng)臂組成(長(zhǎng)30 cm,寬8 cm,高15 cm),相鄰臂之間的角度為 120 °。小鼠初始置于迷宮的中心位置,并允許自由探索3個(gè)臂10 min。自發(fā)輪替行為定義為大鼠依次連續(xù)進(jìn)入3個(gè)不同臂為1次。最大輪替次數(shù)=自發(fā)輪替次數(shù)-2;自發(fā)輪替行為百分比=自發(fā)輪替次數(shù)/最大輪替次數(shù)×100%。動(dòng)物自發(fā)輪替行為比例較高時(shí)被認(rèn)為具有較好的空間工作記憶能力。(2)Morris水迷宮測(cè)試:于建模后14 d、28 d行Morris水迷宮定位航行測(cè)試。將小鼠放置于Morris水迷宮系統(tǒng)(直徑90 cm、高60 cm的圓形不銹鋼水池+深度為30 cm的無毒不透明液體)中,將圓形水池平均分為4個(gè)象限,在其中1個(gè)象限中央放置1個(gè)圓柱形隱藏平臺(tái),小鼠隨機(jī)從水池的4個(gè)入水點(diǎn)頭朝池壁入水,任其游泳,直到找到平臺(tái),小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間和軌跡由水池上方的攝像機(jī)記錄,每次試驗(yàn)后將小鼠烘干并休息20 min后進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn);記錄小鼠每次尋找平臺(tái)的逃避潛伏期。

1.4.2 腦組織BDNF表達(dá) 造模后14 d行為學(xué)評(píng)估后,于麻醉下取小鼠腦組織,分離傷側(cè)前額葉皮層和海馬結(jié)構(gòu),按試劑盒操作流程提取蛋白液,BCA法測(cè)定蛋白濃度并配平。行經(jīng)SDS-PAGE電泳,并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。封閉抗體后,加入抗BDNF、抗GAPDH (1∶500) 4 ℃孵育過夜孵育,漂洗后加入辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的二抗 (1∶500) 孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影。以假手術(shù)組BDNF/GAPDH灰度比為1,計(jì)算其他各組條帶相對(duì)灰度比。

1.4.3 海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡 于建模后7 d麻醉小鼠后制備腦組織冰凍切片,采用TUNEL法進(jìn)行檢測(cè)。常規(guī)行脫蠟、復(fù)水和抗原修復(fù)處理,使用TUNEL試劑盒,PBST溶液洗脫玻片(3次、10min/次),滴加核染色劑,室溫下處理5 min;PBST溶液洗脫,滴加抗熒光衰減液5 μL,封片;熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)比較

在Y型迷宮試驗(yàn)中,與假手術(shù)組比較,手術(shù)對(duì)照組小鼠造模后7～14 d自發(fā)輪替行為百分比減少(P<0.05)。與手術(shù)對(duì)照組小鼠相比,丁苯酞處理組1小鼠在7～14 d時(shí)自發(fā)輪替行為百分比有一定上升,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;丁苯酞處理組2小鼠自發(fā)輪替行為百分比上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩丁苯酞處理組間比較,組2小鼠14 d時(shí)自發(fā)輪替行為百分比高于組1 (P<0.05)。見圖1。

在Morris水迷宮試驗(yàn)中,與假手術(shù)組比較,手術(shù)對(duì)照組小鼠造模后7～14 d逃避潛伏時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)。與手術(shù)對(duì)照組小鼠相比,丁苯酞處理組1小鼠在14 d時(shí)逃避潛伏時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05),但在28 d時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);丁苯酞處理組2小鼠在14 d及28 d時(shí)均低于手術(shù)對(duì)照組 (P<0.05)。見圖2。

2.2 各組小鼠海馬和前額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)BDNF表達(dá)比較

TBI后14 d,小鼠海馬及額葉前內(nèi)側(cè)皮質(zhì)均下調(diào)(P<0.05)。與手術(shù)對(duì)照組相比,丁苯酞處理組1小鼠海馬BDNF表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05);丁苯酞處理組2小鼠海馬及前額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)BDNF表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)。兩丁苯酞處理組間比較,組2小鼠前額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)BDNF上調(diào)高于組1(P<0.05)。見圖3。

2.3 各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況比較

TBI后7 d,各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡率比較:假手術(shù)組<丁苯酞處理組2<丁苯酞處理組1<手術(shù)對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

顱腦損傷的發(fā)生與外部因素作用于腦組織造成的神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān),輕度顱腦損傷患者的神經(jīng)功能可在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù),但受臨床癥狀不明顯、影像學(xué)表現(xiàn)不典型、治療延誤等因素的影響,部分患者可能出現(xiàn)傷后遠(yuǎn)期神經(jīng)退行性變和認(rèn)知功能障礙,影響患者整體預(yù)后,需要引起更多的關(guān)注。

丁苯酞是指南[7-8]推薦的神經(jīng)保護(hù)劑,可通過上調(diào)NF-E2相關(guān)因子2(Nrf-2)/血紅素氧合酶1信號(hào)通路表達(dá)及其他多種機(jī)制,對(duì)腦損傷大鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用。本研究通過構(gòu)建小鼠顱腦損傷模型,探討了丁苯酞對(duì)腦外傷后認(rèn)知障礙的保護(hù)作用。研究顯示,實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織在遭受外力打擊后,出現(xiàn)明顯的空間記憶功能損傷,表現(xiàn)為Morris水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏時(shí)間延長(zhǎng)和Y型迷宮試驗(yàn)自發(fā)輪替行為減少。丁苯酞干預(yù)對(duì)這些指標(biāo)具有改善作用,并至少可持續(xù)至顱腦損傷后28 d,提示其在腦外傷后急性期及亞急性期對(duì)認(rèn)知功能受損具有保護(hù)作用。

據(jù)報(bào)道[9]丁苯酞可靶向調(diào)控Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap-1),抑制Keap-1與Nrf-2的相互作用,激活細(xì)胞抗氧化活性,減輕氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮腦保護(hù)作用。劉俊等[10]研究發(fā)現(xiàn),丁苯酞可通過降低大鼠腦組織炎癥因子的表達(dá)改善腦水腫狀態(tài);Wang等[11]也發(fā)現(xiàn),丁苯酞在腦震蕩性腦損傷中可明顯降低腦組織含水率,具有較好的腦保護(hù)作用。這些機(jī)制可能是丁苯酞在腦損傷急性期發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

BDNF做為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑,參與了神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。顱腦損傷后BDNF可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建,減輕繼發(fā)性損傷的影響[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),小鼠顱腦損傷后14 d,海馬及前額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)BDNF表達(dá)有明顯下調(diào),這可能是外傷的直接影響,并進(jìn)一步延緩?fù)鈧笊窠?jīng)修復(fù)。外源性補(bǔ)充BDNF難以通過血腦屏障發(fā)揮作用,而丁苯酞干預(yù)能明顯上調(diào)海馬及前額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)BDNF的表達(dá)、促進(jìn)內(nèi)源性BDNF功能,一般認(rèn)為這兩個(gè)腦區(qū)與學(xué)習(xí)認(rèn)知密切相關(guān),因此這可能是丁苯酞發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比,手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞處理1組和2組的神經(jīng)元凋亡率明顯升高;與手術(shù)對(duì)照組比,丁苯酞處理1組和2組的神經(jīng)元凋亡率明顯降低,這從組織細(xì)胞層面表明,丁苯酞可降低顱腦損傷后神經(jīng)元的凋亡,從而對(duì)神經(jīng)功能起到保護(hù)作用。一項(xiàng)有關(guān)丁苯酞對(duì)腦癱大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響的研究[14]發(fā)現(xiàn),丁苯酞可能通過介導(dǎo)磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路,調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)蛋白表達(dá),抑制海馬神經(jīng)元凋亡,促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)。但顱腦損傷后,丁苯酞影響神經(jīng)元凋亡的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。

綜上,丁苯酞可改善小鼠TBI后空間記憶功能,對(duì)認(rèn)知損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,上調(diào)海馬及前額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)BDNF表達(dá)及抑制海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡可能是其潛在機(jī)制。