基于TLR4-NOD信號通路探究潰結靈對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜修復和腸道自噬的影響

周廣泉,李 堃,季 瑜

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是常見的慢性炎性疾病,可表現為腹瀉和血便等。近年研究顯示,UC在全球范圍內發病率逐漸升高,已發展為一個影響全球人群健康的醫療難題[1]。UC發病機制和病因現尚不明確。雖有報道證明,其與遺傳易感性、炎性損傷、自噬、腸屏障損傷和腸道菌群失衡等有關,但病程較長,易反復發作,治愈難度大,嚴重時可進展為結腸癌[2]。對UC西醫主要采用免疫抑制劑和糖皮質激素等進行治療,但由于存在較多不良反應、遠期療效差等原因,不能滿足臨床需要。隨著現代中醫的發展,中醫治療UC已顯現出獨特優勢[3]。潰結靈由黃芪、制大黃、絲瓜絡和珍珠粉組成,是我院季瑜主任治療UC的經驗方,在臨床治療UC方面具有明顯效果。雖然已有研究顯示,潰結靈可改善UC大鼠腸黏膜屏障,提高結腸組織抗炎能力[4-5],但該研究采用的潰結靈與我院潰結靈組方不同。Toll樣受體4(TLR4)-核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NOD)信號通路通過介導炎癥反應參與多種炎性疾病發展,如UC[6]。目前,臨床上關于我院潰結靈與TLR4-NOD信號通路對UC大鼠影響的研究未見報道。因此,本研究探究潰結靈通過調節TLR4-NOD信號通路對UC大鼠腸黏膜修復和腸道自噬的影響,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SD大鼠均購自江蘇珂瑪麒生物科技有限公司,生產許可證SYXK(蘇)2021-0060,體質量180～220 g,6～8周齡,雌雄各半,所有動物在黑暗和光照周期各12 h,恒濕(50±10)%,恒溫(23±2)℃下飼養,自由進食和飲水。本研究經海安市中醫院醫學倫理委員會批準(HZYLL2021-009)。

1.2 主要試劑

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)購于美國Sigma公司;D-乳酸(D-LAC)試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司;二胺氧化酶(DAO)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)購自上海酶研生物科技有限公司;結腸組織自噬相關蛋白1(Beclin1)抗體、自噬相關基因5(ATG5)抗體、TLR4抗體、Toll樣受體2(TLR2)抗體、NOD樣受體蛋白3(NLPR3)抗體及內參β-actin購自英國Abcam公司。

1.3 潰結靈制備

組方為黃芪130 g、制大黃100 g、絲瓜絡100 g、珍珠粉10 g,稱取藥材加10倍水煎煮1 h,過濾后藥渣加5倍水煎煮1 h,過濾后合并濾液,水浴濃縮成含生藥2 g/mL藥液。成人用藥3.6 g/d,體質量以60 kg估算,劑量為0.06 g/kg,根據轉換公式和劑量系數計算出大鼠劑量為0.37 g/kg,低中高劑量按成人5、10、20倍計算,即1.85、3.70、7.40 g/kg。

1.4 動物建模

選擇48只大鼠建立UC大鼠模型,具體參考文獻[7],TNBS和乙醇溶液經灌腸法制備,大鼠禁食(不禁水)24 h,使用水合氯醛(10%)腹腔麻醉后,將100 mg/kg TNBS和0.25 mL乙醇溶液(50%)用改良版大鼠灌胃針緩慢注入大鼠距肛門7～8 cm腸腔內,注射結束后用手捏住肛門停留數分鐘,防止溶液外漏,保證大鼠腹部呈上傾狀態,注意大鼠保暖。另選取12只大鼠作為正常組,采用同樣方法給予等量生理鹽水灌腸。12 h后觀察造模大鼠出現稀便和血便,表明建模成功。

1.5 動物分組

將48只建模大鼠分為模型組(UC組)和潰結靈低、中、高劑量組,每組12只。建模成功后正常組、UC組大鼠灌胃等量生理鹽水,潰結靈低、中、高劑量組大鼠灌胃1.85、3.70、7.40 g/kg潰結靈,每日1次,連續12周。

1.6 病變活動指數(DAI)評分

末次灌胃24 h進行評估。DAI評分從體質量降低、大便形狀和大便隱血或肉眼血便進行評估[8]。體質量下降:降低<1%計0分,1%～<6%計1分,6%～<10%計2分,10%～<15%計3分,≥15%計4分。大便性狀:正常計0分,軟便但成形計2分,軟便不成形計3分,腹瀉計4分。大便隱血或肉眼血便:正常計0分,輕度松散為陰性計1分,稀便但隱血陽性計2分,水樣便但隱血陽性計3分,肉眼血便計4分。DAI=(體質量降低+大便形狀+便隱血或肉眼血便)/3。

1.7 結腸長度和結腸黏膜損傷指數(CMDI)評分

末次給藥后48 h麻醉脫頸處死大鼠,并進行解剖,取小鼠盲腸至肛門端結腸,鋪在白紙上,直尺測量結腸長度。測量結束后,沿腸系膜側線縱向剪開,經預冷磷酸鹽緩沖液沖洗,濾紙吸干水分,平放白紙上,觀察大鼠結腸損傷情況[9]:無損傷計0分,局部水腫但無潰瘍計1分,有1處潰瘍計2分,有2處潰瘍計3分,有多處潰瘍且長度累計<1 cm計4分,有多處潰瘍且至少1處長度>1 cm計5分。

1.8 血清D-LAC、DAO及尿乳果糖(L)/甘露醇(M)檢測

處死大鼠時取各組大鼠心臟血液5 mL,以3 000 r /min離心10 min后收集上清液,按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒操作步驟檢測血清D-LAC和DAO。各組大鼠末次給藥后24 h,取L、M各2 mL灌胃大鼠,收集大鼠24 h尿液,以3 000 r /min離心10 min,取10 mL并加2 mL硫柳汞防腐(0.2 g/L),用高效液相色譜分析法檢測L和M,計算尿L/M。

1.9 血清和結腸組織TNF-α檢測

血清制備:處死大鼠時取各組大鼠心臟血液5 mL,以3 000 r/min離心10 min后取上清液;結腸組織制備:處死大鼠時取1 cm結腸(肛門2 cm處向上取結腸)組織,剪碎后制備勻漿液,經3 000 r/min離心10 min后取上清液。采用雙抗體夾心法測定血清和結腸組織TNF-α。

1.10 Western blot法檢測結腸組織Beclin1、ATG5、TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達

處死大鼠時取大鼠結腸組織0.1 g制備各組大鼠結腸組織勻漿液,并加入蛋白裂解液,以BCA法對蛋白進行定量檢測,將蛋白與上樣緩沖液混合后,行12%凝膠電泳處理(每個槽孔內加40 μg),用半干法迅速轉移至NC膜上,封閉培養1 h,加一抗Beclin1、ATG5、TLR4、TLR2、NLPR3及內參β-actin在4 ℃下過夜孵育,次日加HRP標記羊抗兔二抗室溫下孵育1 h,最后加顯色試劑用于顯影、定影,凝膠系統拍照后,分析蛋白條帶密度值。

1.11 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般情況比較

實驗過程中,正常組大鼠飲食飲水正常、體質量逐漸升高,且大鼠毛發光澤、活動敏捷,未出現稀便情況、肛門周圍潔凈;UC組大鼠食欲降低,出現懶動、精神萎靡,體質量降低,且出現血便、稀便等情況,大便松散;經過12周治療后,潰結靈低、中、高劑量組大鼠隨著藥物劑量增加、治療時間延長,飲食出現明顯好轉,體質量逐步增加,腹瀉癥狀改善明顯。

2.2 大鼠DAI評分結果比較

治療1、2、6和12周,5組大鼠DAI評分總體比較差異均有統計學意義(P<0.01)。與正常組比較,治療1、2、6和12周UC組DAI評分升高;與UC組比較,治療1、2、6和12周潰結靈低、中、高劑量組DAI評分降低;與潰結靈低劑量組比較,治療1、2、6和12周潰結靈中、高劑量組DAI評分降低;與潰結靈中劑量組比較,治療1、2、6和12周潰結靈高劑量組DAI評分降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠不同時間點DAI評分比較分)

2.3 大鼠結腸長度和CMDI評分比較

與正常組比較,UC組結腸長度縮短,CMDI評分升高;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組結腸長度延長,CMDI評分降低;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組結腸長度延長,CMDI評分降低;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組結腸長度延長,CMDI評分降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠結腸長度和CMDI評分比較

2.4 大鼠血清D-LAC、DAO及尿L/M比較

與正常組比較,UC組血清D-LAC、DAO及尿L/M升高;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組血清D-LAC、DAO及尿L/M降低;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組血清D-LAC、DAO及尿L/M降低;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組血清D-LAC、DAO及尿L/M降低(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠血清D-LAC、DAO及尿L/M比較

2.5 大鼠血清和結腸組織TNF-α比較

與正常組比較,UC組血清和結腸組織TNF-α升高;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組血清和結腸組織TNF-α降低;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組血清和結腸組織TNF-α降低;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組血清和結腸組織TNF-α降低(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠血清和結腸組織TNF-α比較

2.6 大鼠結腸組織Beclin1和ATG5表達比較

與正常組比較,UC組結腸組織Beclin1和ATG5表達減少;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組結腸組織Beclin1和ATG5表達增加;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組結腸組織Beclin1和ATG5表達增加;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組結腸組織Beclin1和ATG5表達增加(P<0.05)。見表5和圖1。

Beclin1為自噬相關蛋白1,ATG5為自噬相關基因5,UC為潰瘍性結腸炎。

表5 5組大鼠結腸組織Beclin1和ATG5表達比較

2.7 大鼠結腸組織TLR4-NOD信號通路相關蛋白比較

與正常組比較,UC組結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達增加;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達減少;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達減少;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達減少(P<0.05)。見表6和圖2。

TLR4為Toll樣受體4,TLR2為Toll樣受體2,NLPR3為NOD樣受體蛋白3,UC為潰瘍性結腸炎。

表6 5組大鼠結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達比較

3 討論

UC是炎性腸道疾病,腸道免疫炎癥反應失衡和腸黏膜屏障損傷與UC發生發展密切相關[10]?，F臨床治療UC多以西醫為主,雖然可改善患者腸道屏障功能,并減輕炎癥反應,但治療后可在一定時間內復發[11]。中醫將UC歸為“痢疾”“泄瀉”“腸癖”等范疇,多因脾胃虛弱、或飲食不節、或憂思惱怒等致脾胃損傷,蘊結于腸道,在腸道相互裹挾,致腸道傳導失司、氣血壅滯、腸絡受損,下痢膿血、反復發作[12]。UC病位在腎、脾、大腸,病初多為濕熱內蘊,腸道氣機阻滯病久入絡,久病入腎,而出現脾腎陽虛及寒熱虛實夾雜之證,病機總屬本虛標實[13]。本研究所采用潰結靈主要由黃芪、制大黃、絲瓜絡和珍珠粉組成,黃芪可解毒排膿、利水消腫,制大黃可瀉熱通便、化瘀止血,絲瓜絡可祛風通絡,珍珠粉可養血安神、鎮心定驚,諸藥合用可共奏清熱涼血解毒之功效?，F代藥理實驗顯示,黃芪主要成分黃芪多糖可改善UC腸黏膜損傷[14]。大黃中含蒽醌類化合物,含有蒽醌類成分的中藥制劑在臨床上廣泛使用,以番瀉苷、大黃酸和大黃素為主。已有研究報道顯示,大黃酸對葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎有明顯緩解作用[15]。珍珠粉治療UC效果也非常明顯[16]。由以上論述可見潰結靈治療UC效果確切。

本研究使用TNBS和乙醇溶液給大鼠灌腸,發現UC大鼠腸黏膜明顯損傷,有明顯血便、稀便、體質量降低等現象,且治療不同時間大鼠DAI評分明顯升高。CMDI評分、血清D-LAC和DAO及尿L/M是腸屏障功能受損常用標志物,正常情況下血清中D-LAC和DAO含量較少,尿L/M較低,若腸道出現明顯損傷可促進血清D-LAC、DAO和尿L/M值升高[7]。本研究發現,不同劑量潰結靈灌胃UC大鼠后,可明顯降低不同時間DAI評分,并降低CMDI評分及血清D-LAC、DAO和尿L/M,這與王慧等[7]研究結果相似?？梢姖⒔Y靈可明顯改善UC大鼠腸黏膜屏障功能,有助于腸黏膜修復。

炎癥反應在UC病理機制中起關鍵作用,表現為促炎性因子和抗炎性因子釋放失衡,造成TNF-α等因子分泌增加,加重腸黏膜損傷程度[17]。目前,有研究報道,自噬功能障礙可破壞腸道穩態、影響腸道微生物及促進炎癥反應等,進一步加重腸道黏膜損傷[18]。Beclin1、ATG5是常用自噬相關蛋白或基因,前者是自噬自動蛋白和基因,后者可參與自噬小體合成,對自噬形成起決定作用[19]。本研究結果顯示,UC組血清和結腸組織中TNF-α釋放明顯增加,Beclin1、ATG5表達減少,經過不同劑量潰結靈灌胃后可降低血清和結腸組織TNF-α,增加Beclin1、ATG5表達。表明潰結靈可改善UC大鼠炎癥反應和腸道自噬。

TLRs和NOD為模式識別受體關鍵蛋白家族,通過介導炎癥反應參與疾病進展,TLRs家族成員中TLR4、TLR2是常見因子,TLRs可通過感知病原體中分子模式參與免疫炎癥反應。已有研究報道,TLR4、TLR2在腸黏膜損傷組織中高表達,可通過激活核因子-κB通路、NLRP3炎性小體活性,進而加重結腸炎腸道炎癥反應[20]。本研究發現,UC組結腸組織TLR4、TLR2、NLPR3蛋白表達增加,潰結靈可呈劑量效應關系減少TLR4、TLR2、NLPR3蛋白表達,與上述報道相符。說明潰結靈對UC大鼠炎癥反應、腸道屏障功能等作用可能與調節TLR4-NOD信號通路有關,但具體作用機制尚不清楚,有待進一步探究。

綜上所述,潰結靈可改善UC大鼠腸黏膜屏障功能、腸道自噬,并減輕體內炎癥反應,有利于腸黏膜修復,其作用機制可能與TLR4-NOD信號通路有關,其中高劑量潰結靈效果最為明顯。