肝性腦病大鼠經糞便細菌移植后的腸道菌群宏基因組分析*

王威巍,劉豐睿,呂朝華,申呈祥

(1.重慶市銅梁區人民醫院肝膽胰外科,重慶 402560;2.陸軍軍醫大學第二附屬醫院肝膽外科,重慶 400037)

肝硬化是一種嚴重影響人類生活質量的疾病,會引起如肝性腦病(HE)等嚴重并發癥。近年研究表明,微生物群和宿主之間的聯系在HE的發病機制中起著關鍵作用,因此微生物群落組成和功能不僅可以應用在HE的診斷領域,其治療作用還被探索用于HE的治療[1-2]。

近年來,糞便細菌移植(FMT)已成為生物醫學和臨床醫學的研究熱點。FMT對不同疾病的臨床反應為與各種疾病相關的微生物群-宿主相互作用提供了證據,如重癥感染、糖尿病、癌癥、肝硬化、腸道疾病和其他疾病[3-4]。

近年來,已有學者將FMT安全應用于代償性肝硬化和酒精性肝硬化患者,并取得了有效的臨床結果。對于HE患者,FMT不僅可以改變相關患者的認知功能,還可明顯降低相關不良事件發生風險[5-6]。因此,本研究對HE大鼠進行FMT,通過研究其腸道微生物變化情況,以期進一步了解FMT后何種細菌發揮作用,為深入研究FMT相關機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選擇雄性SPF級SD大鼠30只,體重(250.0±49.0)g,購于湖南安生美藥物研究院有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-0004。各大鼠購回后適應性喂養1周,保持自由飲水、進食,通風,12 h明暗交替。將30只大鼠隨機分為3組:A組為正常對照組,B組為HE模型組,C組為FMT組,每組10只。本研究通過重慶市銅梁區人民醫院倫理委員會審核并批準(2021-40)。

1.2HE大鼠模型的建立 參照前期研究建立HE大鼠模型[7]。四氯化碳、大豆油按2︰3的比例混合,于B、C組大鼠頸背部皮膚皮下注射,首次注射按每100 g體重0.5 mL,而后按每100 g體重0.3 mL注射,每周注射2次;予5%乙醇自來水溶液自飲。A組正常喂養,普通飲水,頸背部皮下注射生理鹽水。造模持續9周。

1.3模型驗證 參照前期研究進行模型驗證[7]。大鼠持續造模9周后,隨機選取B組大鼠5只,A組大鼠1只,7%水合氯醛(每100 g體重0.5 mL)麻醉,暴露肝臟,可見B組大鼠肝臟相比A組大鼠病變明顯,說明造模成功。

1.4各組大鼠的處理 B組進行同等劑量生理鹽水灌胃;C組進行FMT,按200 μL/d(1 mL糞便細菌溶液中含糞便細菌1.5×1011)進行灌胃處理,移植細菌購于河北藍域信科菌群資源中心。每天觀察大鼠生存情況。收集大鼠腸道糞便進行宏基因組測序。

1.5腸道菌群宏基因組分析 參考朱宏斌等[8]的方法,進行細菌宏基因組分析。首先基于 Illumina NovaSeq/HiSeq高通量測序平臺,采用全基因組鳥槍法策略, 將提取獲得的菌群宏基因組總DNA,或宏轉錄組以mRNA為模板合成的cDNA雙鏈,隨機打斷為短片段,并構建合適長度的插入片段文庫,對這些文庫進行雙端測序。每個樣本構建一個文庫。對原始數據進行質量篩查,去除非目的序列(Trimmomatic 0.32,http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic),獲取可用于下游宏基因組分析的高質量數據集。接著,在進行 BBCMS 校正后讀取長序列,使用MEGAHIT進行拼接,構建宏基因組疊連群(contigs)序列集;使用軟件MMseqs2的 linclust 模式將 contigs 序列集按相似度95%、對齊區域覆蓋度90%(占短序列的比例)進行去冗余,獲得非冗余的contigs集合,去冗余后采用專門用于預測原核微生物和宏基因組基因序列的 MetaGeneMark 軟件(http://exon.gatech.edu/GeneMark/)識別其中的開放閱讀框(ORF), 進行基因預測,獲得非冗余氨基酸序列集。隨后,對氨基酸序列使用KEGG數據庫、GO數據庫及EggNOG 數據庫等進行功能注釋,獲得各等級的功能類群豐度譜,并進行功能組成分析、多樣性分析、差異分析等。同時,對高質量數據集、非冗余氨基酸序列進行物種注釋,獲得種及種以下精細水平的物種組成譜,并進行物種組成分析、多樣性分析、差異分析等。物種注釋利用MEGAN比對NR數據庫,利用R軟件繪制門、綱、目、科、屬、種分類等級的物種豐度柱狀圖。

1.6各組大鼠關鍵菌群的LEfSe分析 為了更加了解大鼠腸道菌種的顯著差異,進行LEfse分析。通過 LEfSe 本地分析軟件進行分析,并使用 R 軟件的 ggtree 等包將分析結果可視化。

2 結 果

2.1大鼠一般生存情況和大便情況 實驗過程共死亡大鼠9只,所有大鼠在建模后都出現不同程度嗜睡、反應遲緩及活動量變少情況,偶有厭食及消瘦。在FMT后2周,B組大鼠仍然持續上述變化,C組大鼠開始出現自主活動增加,進食增加并伴隨大便明顯好轉呈正常狀態。移植前,3組大鼠體重比較,差異無統計學意義(P>0.05);移植后,B組大鼠體重較A組明顯下降,C組較B組明顯增加,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠移植前后體重變化

2.2各組大鼠腸道菌群結構差異分析 在門水平上,將注釋到的菌門取20類進行繪制(圖1)。與A組比較,B、C組中變形菌門的豐度升高,擬桿菌門的豐度下降;C、B組進行對比,擬桿菌門的豐度增加,變形菌門的豐度下降,差異均有統計學意義(P<0.05)。在種水平上,將注釋到的菌種取含量前20種的進行繪制(圖2),與A組進行比較,B組中大腸桿菌(Escherichia coli)、擬桿菌(Bacteroides sartorii)、Dorea sp.CAG:317、志賀氏桿菌(Shigella sonnei)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)菌種的含量增加,而普雷沃氏菌(Prevotella sp.)MGM1、P2-180、P5-92及厚壁菌門細菌(Firmicutes bacterium)ASF500、0.1×D8-71、1×D42-67的豐度明顯減少,C組相對B組改善明顯。Dorea sp.CAG:317在C組豐度最高。韋恩圖分析顯示,3組大鼠共有相同菌種19 034種,A組與B組和A組與C組共有相同菌種分別為681、1 327種,B組與C組共有相同菌種1 148種;而有組別特異性的菌種為A組1 200種,B組865種,C組1 151種。

圖1 門水平分布

圖2 種水平分布

將每個樣本的種水平分類單元按其豐度從高到低沿橫坐標依次排列后,將豐度值經log2 對數轉換作為縱坐標,在 R 軟件中編寫腳本繪制各樣本的豐度等級曲線。豐度等級曲線顯示,相對A組來說,B組菌種的豐度明顯降低,FMT后,C組菌種的豐度明顯增加(圖3)。

圖3 豐度等級曲線

2.3各組大鼠關鍵菌群的LEfSe分析 在種水平上,取3組大鼠腸道菌群LDA差異分析對數得分值大于4的菌種進行比較,結果顯示,3組間具有顯著差異的物種分別有擬普雷沃菌科、氣單胞菌科及琥珀酸弧菌科等32種;腸桿菌科、梭狀芽孢桿菌及志賀氏菌等48種;Dorea sp.CAG:317及乳酸桿菌屬12種。不同種間LDA評分的柱狀分布見圖4,差異物種的系統發育分布見圖5。

注:長度越長表明該分類單元的差異越顯著。

圖5 分類學分支圖

3 討 論

HE作為晚期肝硬化住院和發病的最主要原因,在實際治療中,可以用于治療的方案極其有限[9]。人類腸道和肝臟的微生物組通過影響每個系統的健康和疾病狀態而共存,全身炎癥及內毒素血癥等影響腸道微生物的因素是HE發病的主要機制[10]。近年來,微生物-腸道-肝臟軸學說成為研究熱點,肝臟通過門靜脈系統及膽道系統與胃腸道直接相關,因此首先接觸腸源性代謝物、細胞成分和激素等物質,與肝臟免疫細胞相互作用,引起炎癥反應,誘發各種肝臟疾病的進展[11-12]。

腸道菌群是影響腸道功能的一個很重要的因素,關系到肝硬化及其并發癥的進展[13]。FMT最近已成為肝硬化相關疾病的潛在治療方法[14]。鑒于腸道微生物在HE的治療中越來越被重視,現在很多的證據表明腸道微生物和HE的發病機制有關[5]。然而,就病程而言,肝硬化發生在HE之前,加之肝硬化是一個不可逆的過程,因此,研究關注點可能更應該在HE發生之前甚至是早期肝硬化。

眾所周知,肝硬化也是原發性肝癌的一個前置性病變,所以對肝硬化的早期干預也無疑有益于肝癌的防治。越來越多的證據表明,從肝硬化前期到肝硬化、肝功能失代償期直至肝移植,腸道菌群組成和功能的變化在肝臟疾病中起著重要作用[15]。本研究在動物的選擇和FMT模型的構建方法上,作者團隊在前期研究中也做了探索,最終選擇死亡率更低、可重復性和觀察性更好的SD大鼠作為最終的實驗動物[7,16],在建模方法上最終選擇了四氯化碳聯合乙醇的方法構建HE模型[7]。

本研究結果發現,相對B組來說,C組在移植前后能有效改善大鼠的體重,使其體重增長情況更加趨近于A組,B組大鼠相對于A組表現出明顯的下降趨勢,后期也未得到改善。

既往宏基因組研究表明,肝硬化患者腸道菌群豐度存在降低現象,同時發生變化的是潛在致病菌,如腸桿菌科、葡萄球菌科和腸球菌科的相對豐度增加,潛在有益細菌毛螺菌科和瘤胃菌科的相對豐度降低[17]。本研究采用宏基因組手段分析了HE模型大鼠在FMT前后腸道菌群結構和功能的差異化,并對其做了物種 Alpha 多樣性分析,豐度等級曲線結果表明,FMT可以顯著改善HE大鼠腸道菌群的豐度。FMT后,腸道菌群的豐度基本上恢復到了與A組相當的水平。物種結果分析發現,3組分組菌群結構優勢門是擬桿菌門和變性菌門,且相對A組而言,B組變性菌門豐度升高,而許多致病性細菌均屬于這兩門菌屬,如大腸桿菌和痢疾桿菌、沙門氏菌屬。而擬桿菌門豐度呈下降趨勢,普雷沃菌屬是擬桿菌門中優勢屬。相對于B組,C組變性菌門呈現下降趨勢,擬桿菌門呈現升高趨勢。這與前面的一些研究結論吻合[18]。上述研究結果提示,FMT可以有效地恢復肝硬化所帶來的擬桿菌的損耗,同時也有效地抑制肝硬化所帶來的變形菌的增加,因此推測FMT通過改變腸道菌群中不同菌的比例來調節腸道微環境進而達到有效治療HE的目的。

本研究LEfSe分析結果表明,B組顯著表達的菌種有大腸桿菌及梭狀芽孢桿菌等,從構成上來說主要還是以變形菌門腸桿菌科為主,結果和前面的研究相吻合。而經過FMT后,乳酸桿菌及Dorea sp.CAG:317等益生菌占有更大優勢,后者可能通過誘導Treg并抑制Th17細胞的分化和功能,從而調節腸道免疫反應,維持腸道黏膜屏障的完整性和穩定性[19],進而減少腸道有害物質進入門靜脈系統損害肝臟。綜上所述,FMT主要是通過改變腸道菌群中擬桿菌門和變形桿菌門中不同細菌的比例來調節腸道微生物環境,進而影響HE的病程和大腦的功能。作者團隊既往的研究結果表明,FMT可以明顯改善HE大鼠的腸道屏障功能及認知功能,進而改變大鼠的行為。因此有理由認為,FMT是針對肝硬化所致HE的一個潛在治療方案[7],可改善患者的生活質量。

本研究不足之處在于,僅針對腸道細菌改變進行了研究,但對于肝硬化所致HE,大腦組織到底發生了何種改變仍值得研究。隨后將進一步利用功能磁共振研究HE大鼠經FMT后大腦結構及功能,探索其作用機制。