高良姜素調節MCP-1/CCR2信號軸對肺癌細胞惡性生物學行為的影響

秦婷婷 徐洋 楊璐瑜 洪帆 周濤 車瑾

肺癌是呼吸系統中的一類疾病,在全球中都是屬于死亡率最高的癌癥之一,而且隨著人們的生活環境變化,其發病率在不斷上升。而非小細胞肺癌屬于肺癌中最高發的一類癌癥[1-2]。目前臨床上常采用化療的方法治療,但是會產生耐藥而導致效果不佳[3]。因此,對肺癌發生發展的機制研究可能會發現治療肺癌的其它有效途徑。高良姜素,化學名稱為3,5,7-三羥基黃酮,在高良姜和蜂蜜中存在,屬于天然黃酮類化合物[4-5]。對于高良姜素的藥理學研究顯示,其具有降血脂、清除自由基、抗腫瘤以及抗氧化等作用,有研究已經顯示高良姜素可以通過調控相關信號通路從而增強順鉑等化療藥物對于肺癌的治療效果[6-7]。而對于細胞因子單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)也經常被叫做趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2,CCL2)。MCP-1的受體就是趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2,CCR2)。有研究報道,MCP-1可以與CCR2相互作用,進一步參與細胞凋亡、增殖等生理過程。MCP-1屬于促炎性趨化因子,并且與癌癥的預后有關,所以對MCP-1/CCR2信號通路的抑制就成為了新的腫瘤治療策略[8-10]。而高良姜素能否通過調控MCP-1/CCR2信號通路對人肺癌細胞產生影響還未有研究。因此,本研究旨在探究高良姜素對人肺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人肺癌細胞系(A549)來自博輝生物科技(廣州)有限公司。

1.2 主要試劑 高良姜素來自上海瓦蘭生物科技有限公司;RPMI-1640細胞培養液購自愛必信(上海)生物科技有限公司;吉非替尼購自北京凱詩源生物科技有限公司;MCP-1來自上海鴻肽生物科技有限公司;細胞計數試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司;凋亡試劑盒購自上海偉進生物科技有限公司;胎牛血清購自北京博爾西科技有限公司;transwell小室來自北京沃凱生物科技有限公司;兔源一抗MCP-1、Caspase-3、GAPDH購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;兔源一抗CCR2、Ki67、MMP-2購自武漢益普生物科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 細胞培養 將人肺癌細胞A549接種在RPMI-1640完全培養基(含10%FBS、1%雙抗)中并置于37℃、5% CO2的濕潤培養箱中培養。待細胞生長至對數期后進行后續實驗測定。

1.4 細胞分組以及細胞計數試劑盒-8(CCK-8)檢測 將A549細胞以每孔2×105個細胞的濃度接種到96孔板中。培養24 h后,將細胞分為正常培養的ctrl組,以及分別用低濃度高良姜素(25 μmol/L)、高濃度高良姜素(100 μmol/L)[11]、吉非替尼(10 μmol/L)[12]、高濃度高良姜素+MCP-1(100 μmol/L高良姜素+ 75 ng/mL MCP-1)[13]進行孵育處理的細胞組,在培養箱中繼續培養24 h以供后續實驗使用。然后向每個孔中加入10 μL的CCK-8試劑。與細胞一起孵育2 h后,使用多功能酶標儀在450 nm處監測光密度值(吸光度/OD值)并處理分析。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 將A549細胞用胰蛋白酶消化處理后,接種至6孔板(4×105個/mL)并培養48 h。按照1.4步驟的細胞分組并處理,然后根據試劑盒商家的說明,用FITC膜連蛋白V/碘化丙啶雙重染色,通過流式細胞儀(BD FACSCalibur)檢測細胞凋亡。FITC+/PI+和FITC+/PI-的細胞為凋亡細胞,最后分析處理細胞凋亡率。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 將A549細胞接種到6孔板中,等到細胞生長到融合狀態,吸去培養基,用200 μL槍頭尖刮去細胞。然后根據1.4中的分組以及濃度進行處理并孵育48 h,然后使用倒置顯微鏡監測細胞的遷移情況,計算劃痕愈合率。

1.7 Transwell 檢測細胞侵襲能力 首先將處于對數期生長的細胞重懸,備用。Matrigel基質膠稀釋后,加到上室中,孵育4 h后,將重懸的A549細胞加入上室并加入1.4中的分組藥物及相應的濃度,下室中加入含有10%FBS的培養液,在37℃環境中孵育48 h。然后用多聚甲醇固定細胞、結晶紫染色,然后用光學顯微鏡觀察記錄細胞侵襲數。

1.8 western blot檢測MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2蛋白表達 取上述1.4分別處理的A549細胞在RIPA裂解緩沖液中裂解,再加入蛋白酶抑制劑,提取總蛋白。將蛋白質進行定量、電泳、轉移到硝酸纖維素膜上、用脫脂乳封閉,然后將膜與一抗MCP-1(1∶1 000)、CCR2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、Ki67(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4℃下孵育過夜,然后將膜浸泡于HRP標記的二抗孵育液中2 h。加入ECL試劑檢測觀察免疫反應蛋白。使用Image Lab軟件分析目標蛋白的灰度值。

2 結果

2.1 5組A549細胞增殖能力比較 與ctrl組相比,低濃度高良姜素組、高濃度高良姜素組、吉非替尼組的細胞存活率出現下降趨勢(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,細胞存活率有更加明顯的降低(P<0.05);高濃度高良姜素+MCP-1組與高濃度高良姜素組比較,細胞存活率上升(P<0.05)。見表1。

表1 5組A549細胞存活率比較 n=5,%,

2.2 5組A549細胞凋亡比較 通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況。低濃度高良姜素組、高濃度高良姜素組、吉非替尼組與ctrl組比較,A549細胞凋亡率升高(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,細胞凋亡率升高,差異有統計學意義(P<0.05);而高濃度高良姜素+MCP-1組與高濃度高良姜素組比較,細胞凋亡率又出現降低趨勢(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 流式細胞術檢測5組A549細胞凋亡水平

表2 5組A549細胞凋亡率比較 n=5,%,

2.3 5組A549細胞遷移能力比較 通過劃痕實驗測定細胞的遷移能力。低濃度高良姜素、高濃度高良姜素組、吉非替尼組的A549細胞劃痕愈合率與ctrl組比較降低(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,細胞劃痕愈合率降低(P<0.05);與高濃度高良姜素組比較,高濃度高良姜素+MCP-1組A549細胞劃痕愈合率升高(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 劃痕實驗檢測A549細胞遷移(×100)

表3 5組A549細胞劃痕愈合率比較 n=5,%,

2.4 5組A549細胞侵襲能力比較 通過Transwell實驗測定細胞的侵襲能力。低濃度高良姜素、高濃度高良姜素組、吉非替尼組組的A549侵襲細胞數與ctrl組比較明顯減少(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,細胞侵襲數降低(P<0.05);與高濃度高良姜素組比較,高濃度高良姜素+MCP-1組A549細胞侵襲細胞數增加(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 Transwell實驗檢測A549細胞侵襲(結晶紫染色×200)

表4 5組A549細胞侵襲細胞數 n=5,個,

2.5 5組A549細胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2相關蛋白表達比較 與ctrl組比較,低濃度高良姜素組、高濃度高良姜素組、吉非替尼組的MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表達降低,Caspase-3蛋白表達升高(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表達降低,Caspase-3蛋白表達升高(P<0.05);與高濃度高良姜素組比較,高濃度高良姜素+MCP-1組MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表達出現升高現象,而Caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)。見圖4,表5。

圖4 western blot檢測A549細胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3蛋白表達;A ctrl組;B 低濃度高良姜素組;C 高濃度高良姜素組;D 吉非替尼組;E 高濃度高良姜素+MCP-1組

表5 5組A549細胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2蛋白表達比較 n=5,

3 討論

肺癌屬于發病率和死亡率都很高的疾病之一,而且由于科技的發展,人們的生活環境、方式等發生了重大改變,也會影響肺癌的發生,且發生趨勢呈上升狀態[14-15]。而且腫瘤的發生與腫瘤微環境也密不可分,其中大量的作用因子也會影響腫瘤的發展[16]。因此本文針對肺癌細胞中的趨化因子,檢測高良姜素對于癌細胞的影響。

高良姜素主要是從高良姜中提取得到的,具有抗炎、抗氧化和抗過敏、抗腫瘤等良好的藥理作用。相關文獻報道,高良姜素對呼吸相關疾病有較好的作用[17]。而肺癌就類屬于呼吸系統的疾病,所以本研究選取高良姜素探究其對人肺癌細胞的影響。結果顯示,低、高濃度高良姜素以及吉非替尼處理均可降低人肺癌細胞的凋亡率,增殖水平,細胞創傷愈合率,以及細胞侵襲性,且高良姜素濃度越高,對應指標的變化趨勢越明顯。而高濃度高良姜素處理的人肺癌細胞對上述指標的影響與吉非替尼處理后相比較的差異無統計學意義,表明高良姜素可促進人肺癌細胞凋亡,增殖、遷移和侵襲。

已經有團隊報道了有關MCP-1、CCR2信號通路的抗腫瘤作用,即在母細胞瘤中,CCR2的已知配體MCP-1,在腫瘤中高表達并募集CCR2從而促進腫瘤發展[18]。MCP-1/CCR2對于腎臟免疫細胞浸潤也有作用,抑制MCP-1/CCR2就可以緩解慢性腎臟病;MCP-1還可以促進人類乳腺癌的發展,以及小鼠乳腺腫瘤的發展即MCP-1與腫瘤發生發展密切相關[19-20]。而研究MCP-1/CCR2信號通路與肺癌相關性的研究較少,基于MCP-1/CCR2信號通路的已有作用,本文進行了相關探究。結果顯示與相關研究作用結果相似,人肺癌A549細胞MCP-1、CCR2蛋白表達升高,Caspase-3蛋白表達降低;低、高濃度高良姜素、吉非替尼處理均可降低人肺癌A549細胞中MCP-1、CCR2蛋白表達,升高Caspase-3蛋白表達。且高良姜素濃度越高,對MCP-1、CCR2、Caspase-3蛋白表達的作用越明顯,推測高良姜素可能通過抑制MCP-1/CCR2信號通路促進對人肺癌細胞的凋亡等生物學行為影響。為了驗證該猜想,本研究利用增加趨化因子MCP-1來干預高濃度高良姜素處理的人肺癌細胞,結果顯示,MCP-1減弱了高濃度高良姜素對人肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用,并抑制了細胞凋亡。證實了高良姜素可能通過抑制MCP-1/CCR2通路抑制人肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。

綜上所述,高良姜素可能通過抑制MCP-1/CCR2通路抑制人肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為,促進細胞凋亡。該研究為開發新的通過抑制MCP-1/CCR2信號通路治療肺癌的藥物提供了理論基礎。然而,本研究尚存在不足之處,即高良姜素在體內對于抑制MCP-1/CCR2信號通路的影響效果尚且不知,而且可能高良姜素對肺癌還有不同的作用機制,有待后續實驗的進一步深入探究。