樺木酸通過Wnt/β-catenin信號通路調控瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲和膠原合成

唐悅玲 李心怡

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合異常形成的瘢痕組織,病變超出損傷部位范圍,持續生長且無自愈傾向[1]。瘢痕疙瘩不僅引起疼痛和瘙癢等不適反應,而且影響正常身體功能,同時也影響美觀,給患者的生活質量和身心健康帶來極大的損害[2]。大量細胞參與瘢痕疙瘩的形成過程,其中成纖維細胞處于核心位置[3]。成纖維細胞功能異常活化,導致細胞異常增殖和膠原過度合成,從而導致瘢痕不斷生長和擴大,形成瘢痕疙瘩,具有類似腫瘤細胞的特征,因此瘢痕疙瘩又被成為皮膚良性腫瘤[3]。目前,瘢痕疙瘩的臨床治療手段多種多樣,但是治療效果卻不令人滿意,并且治療后復發率極高[4]。近年來,中藥治療瘢痕疙瘩取得了一定的進展,受到了廣泛的關注和研究[5]。特別是鑒定中草藥中對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲和膠原合成具有調控作用的活性單體成分,是目前研究的熱點,有望為瘢痕疙瘩的治療提供新的突破口。Wnt/β-catenin信號通路是目前研究比較廣泛的信號通路,參與調控細胞增殖、分化、凋亡和遷移等細胞生物學過程,其異常調控和疾病的發生密切相關[6]。β-catenin在該通路的信號傳導過程中處于中心位置。當沒有Wnt信號時,β-catenin在細胞質內被降解,維持在極低的水平。當Wnt信號激活時,β-catenin的降解復合體解散,導致β-catenin在細胞質內積累,隨后進入細胞核,與T細胞因子/淋巴增強因子(T-cell factor/Lymphoid enhancing factor,TCF/LEF)轉錄因子結合,調控Wnt靶基因表達,產生生物學效應[7]。研究表明,Wnt/β-catenin信號通路的過度激活和瘢痕疙瘩的形成密切相關[8]。研究發現,β-catenin及其下游靶分子在瘢痕疙瘩和分離的成纖維細胞中都呈高表達狀態[9]。抑制Wnt/β-catenin信號通路可以有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、遷移和膠原合成[10-11]。因此,鑒定具有抑制Wnt/β-catenin信號通路活性的中藥單體成分,對于治療瘢痕疙瘩具有重要的參考價值。樺木酸(betulinic acid,BA)是一種可從多種草本植物中提取出的羽扇豆烷型五環三萜類活性物質,其在樺樹皮中的含量最高,具有抗腫瘤、抗菌、抗炎和抗纖維化等廣泛的藥理作用[12-13]。近年來,BA的生物活性及其治療疾病的潛在價值受到國內外學者的廣泛關注。本研究探討BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲和膠原合成的調控作用,并探討其可能的分子作用機制,為BA應用于瘢痕疙瘩的治療提供初步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 BA(分析標準品,HPLC≥98%)購自上海藍木化工有限公司;細胞培養基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司;CCK-8試劑盒、EdU試劑盒、TOPFlash報告基因質粒、Lipo8000轉染試劑和螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司;Trizol總RNA提取試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司;cDNA合成試劑盒PrimeScript RT reagent Kit和定量PCR試劑盒TB Green Fast qPCR Mix購自大連寶生物工程有限公司;蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和ECL發光試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;兔抗人Col Ⅰ抗體、β-catenin抗體、c-myc抗體、cyclin D1抗體和GAPDH抗體自武漢三鷹生物技術有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細胞分離和培養:在無菌條件下,將手術切除的新鮮瘢痕疙瘩組織轉移到實驗室。在超凈工作臺內,將組織放入培養皿中,加入含有1%雙抗的0.9%氯化鈉溶液,漂洗,去除皮下組織。將瘢痕疙瘩剪成0.5～1 mm3的碎塊,用鑷子將小塊接種于培養瓶中,滴加少量胎牛血清,以便組織塊貼壁。將培養瓶放入培養箱內,瓶底朝上。孵育5 h,待組織塊完全貼壁,加入2 mL含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基,繼續培養,每3天更換1次培養液。待組織塊周圍爬滿細胞時,去除組織塊和培養液,PBS洗滌2次。加入胰酶消化液,孵育3 min。顯微鏡下觀察,待細胞收縮,間隙變大時,加入2 mL含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基,終止消化。采用移液槍反復吹打,使細胞懸浮。將細胞懸液收集到離心管,離心收集細胞沉淀,再次加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基,轉移到新的培養瓶中繼續培養。每2天更換培養基1次,待細胞融合度到達80%以上,進行傳代。取3～4代細胞,進行后續實驗。

1.2.2 CCK-8實驗:將瘢痕疙瘩成纖維細胞常規消化,制成細胞懸液,按照3 × 103個/孔的密度,細胞接種到96孔板,每組設5個復孔。過夜孵育,待細胞貼壁后,加入不同濃度的BA處理,繼續孵育24 h。取出培養板,吸去培養液,向每孔加入10 μL的CCK-8試劑,置于培養箱中,繼續孵育。培養2 h后,取出培養板,置于酶標儀上。調節酶標儀,于450 nm波長處,測定細胞溶液在的吸光度。

1.2.3 細胞分組:將瘢痕疙瘩成纖維細胞分為3組:空白對照組、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)處理組(溶劑對照組)和BA處理組。加藥后,充分混勻,置于細胞培養箱中孵育24 h,然后進行相關檢測。

1.2.4 EdU實驗:將瘢痕疙瘩成纖維細胞接種到含蓋玻片的6孔培養板中,過夜培養,待細胞恢復到正常狀態,加入BA處理。培養24 h后,將37℃預熱的EdU工作液,等體積的加入到6孔板中,使終濃度達到10 μmol/L。加入EdU后,繼續孵育2 h。倒掉培養液,加入1 mL 的4%的多聚甲醛,室溫固定15 min。倒掉固定液,PBS洗滌細胞3次。加入1 mL 的通透液,室溫孵育15 min。倒掉通透液,PBS洗滌細胞3次,加入0.5 mL的EdU反應液,輕輕搖晃培養板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品,室溫避光孵育30 min。倒掉反應液,PBS洗滌3次,加入1 mL的DAPI溶液復染,室溫避光孵育10 min。PBS洗滌3次,采用抗熒光淬滅封片液,進行封片,隨后在熒光顯微鏡下觀察和采集圖像。

1.2.5 流式細胞術:采用胰酶消化待檢測的細胞,離心收集細胞沉淀,預冷的PBS洗滌2次。收集1×105細胞,加入100 μL 1 × Binding Buffer重懸細胞。向細胞懸液中加入5 μL的 Annexin V-FITC和10 μL的PI 試劑,室溫避光孵育15 min。然后,加入400 μL 1 × Binding Buffer,輕搖混勻,立即采用流式細胞儀檢測。

1.2.6 Transwell實驗:采用胰酶消化瘢痕疙瘩成纖維細胞,重懸于不含血清的培養基中,制成濃度為5 × 104個/mL的細胞懸液。將Transwell上室提前鋪好基質膠。待干燥后,將200 μL瘢痕疙瘩成纖維細胞懸液接種到上室,并添加BA。向下室注入500 μL含20%胎牛血清的培養液。將Transwell系統置于培養箱中,孵育24 h。取出小室,倒掉剩余液體,用棉棒擦除殘留細胞。加入4%多聚甲醛溶液固定30 min;PBS洗滌,加入結晶紫染液,染色10 min。流水緩緩沖洗,去除染色液。待小室風干后,置于顯微鏡下觀察和采集圖像。

1.2.7 Western blot:倒掉培養液,預冷PBS洗滌細胞,加入細胞裂解液,劇烈震蕩,冰上孵育30 min。4℃離心,收集上清,采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。向蛋白樣品中加入上樣緩沖液,沸水煮沸5 min,使蛋白變性。按30 μg/孔的上樣量,將蛋白樣品加入道濃縮膠中,進行電泳。待電泳結束,取出分離膠,將濾紙、凝膠和PVDF膜制成“三明治轉模結構”,進行轉模。轉模完成后,取出PVDF膜,放入封閉液中,室溫孵育1 h。然后,將膜與一抗稀釋液孵育,4℃過夜。TBST洗膜,將膜與二抗稀釋液孵育,室溫孵育1 h。將發光液A和B混勻,均勻涂抹在膜上。將膜放入凝膠成像儀中,進行曝光和圖像采集。

因此，中心日間手術開展前，籌備小組認真研究和借鑒歐美的日間手術流程和指南，并實地考察四川大學華西醫院等國內率先開展日間手術的醫院，再結合中心兒科專科手術、婦科手術特點等，最終確定采用，以麻醉醫生為主導的圍術期管理模式，對日間手術中心進行管理。

1.2.8 熒光素酶報告基因實驗:將瘢痕疙瘩成纖維細胞接種到24孔板,過夜孵育培養,待細胞融合度達到80%左右,采用Lipo8000轉染試劑將TOPFlash報告基因質粒轉染至細胞內。細胞轉染48 h后,加入BA處理,繼續培養24 h。每孔加入螢火蟲螢光素酶檢測試劑200 μL,室溫孵育10 min。采用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性。

1.2.9 RT-qPCR:根據Trizol試劑抽提步驟,提取細胞總RNA。取1 μg總RNA為模板,加入,加入逆轉錄酶溶液、緩沖液和反轉錄引物配,補加無RNase的水,配置成20 μL反應體系。反轉錄反應條件設置為37℃,15 min;85℃,5 s。取2 μL逆轉錄反應產物,加入TB Green Fast qPCR Mix和正反擴增引物,補加無菌水,配置成25 μL反應體系。PCR反應條件設置為95℃,30 min;95℃,5 s 和60℃,10 s(40個循環)。以GADPH為內參基因,采用2-ΔΔCt公式計算析mRNA相對表達水平。

2 結果

2.1 BA處理抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長活性 BA為白色結晶,分子式為C30H48O3,相對分子質量為456.7。采用CCK-8實驗檢測了不同濃度BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長活性的影響。與空白對照組相比,不同濃度BA處理后,瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長活性降低,差異有統計學意義(P<0.05和P<0.01)。在30 μmol/L BA處理后,瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長活性大約減少1/2,后續實驗將采用30 μmol/L BA處理細胞進行研究。見圖1,表1。

表1 BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞生長活性的影響 %,

圖1 BA化學結構式

2.2 BA處理抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖 采用EdU實驗檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組EdU陽性細胞的比例下降,差異有統計學意義(P<0.01)。見表2,圖2。

表2 3組細胞增值率比較 %,

圖2 EdU實驗檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響(EdU染色×200)

2.3 BA處理促進瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡 采用Annexin V-FITC/PI對瘢痕疙瘩成纖維細胞染色,然后采用流式細胞術分析BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組凋亡細胞比例上升,差異有統計學意義(P<0.01。見圖3,表3。

表3 3組細胞凋亡率比較 %,

圖3 流式細胞術檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的影響

2.4 BA處理抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的侵襲 采用Transwell實驗檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞侵襲的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組細胞侵襲數目降低,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4,表4。

表4 3組細胞侵襲能力比較 個,

圖4 Transwell實驗檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞侵襲能力的影響染色(結晶紫染色×200)

2.5 BA處理抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的膠原合成 采用Western blot檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞的膠原合成的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組Col Ⅰ蛋白表達量減少,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5,表5。

表5 3組細胞ColⅠ蛋白表達相對定量分析

圖5 Western blot檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原合成的影響

2.6 BA處理下調瘢痕疙瘩成纖維細胞中的Wnt/β-catenin信號通路 采用熒光素酶報告基因實驗評估BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞中的Wnt/β-catenin信號通路的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組Wnt/β-catenin信號通路的活性降低,差異有統計學意義(P<0.01)。Western blot檢測結果顯示,與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組β-catenin蛋白量減少,差異有統計學意義(P<0.01)。采用RT-qPCR檢測BA對Wnt/β-catenin靶基因c-myc和cyclin D1表達的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組c-myc和cyclin D1的mRNA表達水平下降,差異有統計學意義(P<0.01)。Western blot結果進一步證實,與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組c-myc和cyclin D1的蛋白量減少,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖6、7,表6～9。

表6 BA對Wnt/β-catenin信號通路的影響 RLU × 107,

表7 3組細胞β-catenin蛋白表達相對定量分析

表8 RT-qPCR檢測BA對c-myc和cyclin D1 mRNA表達的影響

表9 3組細胞c-myc和cyclin D1 蛋白表達相對定量分析

圖6 Western blot檢測BA對β-catenin蛋白表達的影響

圖7 Western blot 檢測BA對c-myc和 cyclin D1蛋白表達的影響

3 討論

中藥治療瘢痕疙瘩歷史悠久,療效顯著,越來越受到重視,從中藥中鑒定療效確切、不良反應少的單體活性化合物,是目前的研究的熱點,有望為瘢痕疙瘩的治療提供新的突破口。BA具有廣泛的藥理活性,本研究檢測了BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞生物學功能的影響,初步探討BA治療瘢痕疙瘩的潛在價值。本研究發現,BA可有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長、增殖、遷移和膠原合成,而促進細胞凋亡。進一步的分子機制研究表明,BA可能通過下調Wnt/β-catenin信號通路在瘢痕疙瘩成纖維細胞中發揮作用。

研究表明,BA具有顯著的抗腫瘤活性,可抑制腫瘤細胞的生長、增殖、遷移和侵襲,并且誘導腫瘤細胞凋亡[14-17]。瘢痕疙瘩被認為是一種良性腫瘤,其中成纖維細胞的生物學功能異常活化,具有類似腫瘤細胞的特征。目前,關于BA是否對瘢痕疙瘩成纖維細胞的生物學功能具有調控作用,尚未見報道。因此,本研究首次對BA在瘢痕疙瘩成纖維細胞中作用進行了探討。研究發現,BA可以顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長活性。進一步的檢測實驗表明,BA可以有效降低制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、侵襲和膠原合成,而促進細胞發生凋亡。這些結果表明,BA具有逆轉瘢痕疙瘩成纖維細胞異常生物學功能的作用,可能對瘢痕的形成和生長具有抑制作用,可作為治療瘢痕疙瘩的潛在藥物。

BA具有較強的抗纖維化作用,可以很好的抑制心、肝、肺和腎等器官的纖維化[18-21]。據報道,BA可以抑制肝星狀細胞向成纖維細胞轉化,抑制細胞增殖、遷移和膠原合成,從而減輕肝纖維化的進展[22]。BA還可以抑制肺成纖維細胞中膠原合成,從而延緩肺纖維化的進展[20]。本研究表明,BA對成纖維細胞的生長、增殖、凋亡、侵襲和膠原合成等生物學功能具有顯著的調控作用,進一步證實了BA的抗纖維化作用,也拓展了BA對瘢痕疙瘩成纖維細胞的調控作用。本研究為BA的抗纖維化活性,提供了進一步的理論依據。

Wnt/β-catenin信號通路在瘢痕疙瘩的形成過程中發揮關鍵作用[8]。研究表明,Wnt/β-catenin信號通路相關分子,包括β-catenin和下游靶基因在瘢痕疙瘩及分離的成纖維細胞中,都成高表達狀態[9]。抑制Wnt/β-catenin信號通路可以有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、遷移和膠原合成[10-11]。已有研究報道發現,BA具有抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性。BA處理腫瘤細胞可以下調β-catenin和c-myc的表達,從而發揮抑癌作用[23]。Li等[20]報道,BA可阻斷Wnt配體和膜受體的結合,從而下調β-catenin和下游靶基因的表達,抑制Wnt/β-catenin信號通路的信號傳導過程。這些研究表明,BA對Wnt/β-catenin信號通路具有抑制活性。鑒于Wnt/β-catenin信號通路在瘢痕疙瘩的形成過程中發揮關鍵作用,本研究檢測了BA是否影響瘢痕疙瘩成纖維細胞中Wnt/β-catenin信號通路傳導過程。通過熒光素酶報告基因實驗結果發現,BA處理可有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性。進一步檢測發現,β-catenin以及下游靶基因c-myc和cyclin D1的表達水平在BA處理的瘢痕疙瘩成纖維細胞中都顯著降低。這些結果表明,BA可以下調瘢痕疙瘩成纖維細胞中的Wnt/β-catenin信號通路。

綜上所述,BA具有抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲和膠原合成的活性,其分子作用機制可能與負向調控Wnt/β-catenin信號通路相關。鑒于成纖維細胞的異常活化是瘢痕疙瘩形成和發展的關鍵,因此BA具有治療瘢痕疙瘩的潛在價值。