乙酰化多糖的制備、鑒定及其降糖作用機制的研究進展

郭鵬，陳萌，王文照，楊春娟，周詩晴，杜宜遜，馮婷婷，吳延麗

（哈爾濱醫科大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150081）

近年來，糖尿病作為全球性復雜代謝性疾病日益受到關注。其包括Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、特殊類型糖尿病及妊娠糖尿病，尤以Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）發病最為普遍[1-2]。生理表現為由糖代謝紊亂所致的高血糖，常伴隨有動脈粥樣硬化、心腦血管疾病等[3]。臨床上通常考慮對癥治療，但易產生毒副作用，如胰島素注射會導致低血糖癥及過敏反應等[4-5]。多糖作為天然藥物降糖活性成分的代表，具有來源廣泛[6]、生物相容性高[7]、生物活性強[8-11]、毒副作用小[12]等特點，成為當前醫藥領域研究的熱點。

多糖及其衍生物的結構與活性有著非常密切的聯系，部分多糖本身活性較低甚至無活性，或由于多糖的水溶性較差，從而影響其活性的發揮。研究表明，對多糖進行結構修飾，可改善溶解性，增強其原有活性，甚至產生出新的活性，且不易產生毒副作用[13-14]。乙酰化修飾是多糖結構修飾的常用手段，通過乙酰化修飾，可使多糖分子的羥基得以暴露，有效提高多糖的溶解度，此外引入乙酰基的數量和位置對多糖的生物活性也有重要影響[15]。目前，國內外對多糖的乙酰化修飾及其降糖機制綜述仍不全面，本文對近幾年國內外文獻進行整理，并分析各種制備方法的優缺點，探討潛在的降糖新機制，對多糖的乙酰化修飾及其降糖機制的研究展開綜述，以期為將其發展為降糖藥物提供研究思路。

1 乙酰化多糖的制備

1.1 NaOH-乙酸酐法

該法以水為溶劑，通過NaOH 控制反應體系的堿度，以保證活性羥基親核取代反應的順利進行。該方法為實驗室制備乙酰化多糖的最常用方法，具有條件溫和、試劑易得、所得多糖結構完整、不易破壞多糖分子的三螺旋結構等優點，可以較大限度地保護多糖的完整結構，進而避免多糖本身的活性受到破壞。但是以該法為主要方法制備的乙酰化多糖取代度普遍較低，其原因可能是乙酸酐水解的副反應[16]。Chen 等[17]通過加入不同量的乙酸酐，控制反應體系pH 值為8.0~8.5，獲得了3 種不同取代度的乙酰化靈芝多糖。Liu 等[18]同樣采用NaOH-乙酸酐法制備乙酰化青錢柳葉多糖，獲得了取代度為0.13 的目標產物，且并未表現出明顯的細胞毒性。

1.2 吡啶-乙酸酐法

該法多以二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）代替水作為溶劑，加入適量的吡啶作為催化劑，不僅可以提高多糖的溶解程度，還可以避免乙酰化試劑的分解，加快反應體系中的乙酰化反應，有利于獲得較高取代度的乙酰化多糖。Song 等[19]在研究中發現，加入吡啶后，乙酰化南瓜多糖的取代度由0.28 上升到0.67，并在后續的抗氧化試驗中表現出更強的活性。Du等[20]以純化后的銀耳多糖為原料，在DMSO 反應體系中獲得了取代度為0.23 的乙酰化銀耳多糖，乙酰化修飾前后的多糖分子量差異不大，表明乙酰化過程中并未發生多糖的降解。

1.3 甲酰胺-乙酸酐法

采用甲酰胺代替DMSO 作為溶劑，可進一步提高多糖分子的溶解度，此法更大程度地暴露了多糖的羥基，可能會對多糖的結構產生較大影響，由該法制得的一些乙酰化多糖的活性不升反降。李順峰等[21]發現，甲酰胺體系制得的乙酰化香菇多糖在抗氧化試驗中，表現出較NaOH-乙酸酐法制備的乙酰化香菇多糖和未經修飾的多糖更低的活性。經過剛果紅試驗發現，甲酰胺體系中得到的乙酰化香菇多糖的三螺旋結構消失，可能是活性降低的關鍵。Hu 等[22]同樣采用甲酰胺-乙酸酐法制備乙酰化藤五加多糖，在抗氧化試驗中發現，兩種乙酰化藤五加多糖活性均低于未修飾乙酰化多糖，但并未對活性降低的原因進行深入探究，猜測與強烈反應所致的多糖三螺旋結構破壞有關。

1.4 其他方法

由于乙酰化反應條件比較溫和，可通過更換不同溶劑、不同乙酰化試劑及不同催化劑進行反應。Chan等[23]以四氫呋喃為溶劑，制備了乙酰化灰樹花多糖肽，乙酰化后的多糖肽對體內腫瘤治療輔助作用和體外細胞生長抑制作用更明顯。曾輝等[24]采用無水乙酸鈉作為催化劑制備乙酰化魔芋多糖，通過控制單因素變量來確定較優的制備工藝：乙酸酐與魔芋多糖的摩爾比15∶1，反應溫度60~80 ℃，反應時間0.5~1.5 h，無水乙酸鈉用量0.4~0.8 g。

多糖乙酰化修飾的總體思路為以一定量的溶劑（有機溶劑、水等）將多糖溶解，隨后加入乙酰化試劑，反應體系的pH 值則是保證反應順利進行的關鍵。選取適當的催化劑可以有效提高乙酰化程度，而乙酰化取代度決定了乙酰化多糖的物理、化學性質和生物活性，低取代度的乙酰化多糖表現出良好的溶解性，而高取代度的乙酰化多糖則賦予多糖更好的凝膠性[25]。不同多糖有著不同的單糖組成及三維結構，故而乙酰化反應發生的難易程度和最佳反應條件必然有所不同。在乙酰化反應的過程中，需時刻關注多糖的降解程度及其結構是否遭到破壞。簡而言之，多糖本身結構受到破壞后，對其各項生物活性都會產生負面影響，相反，空間結構保持較好的乙酰化多糖，其生物活性多數出現不同程度的增強。

2 乙酰化多糖的鑒定方法

2.1 傅里葉變換紅外光譜法

紅外光譜檢測是多糖結構鑒定的常用手段[26]，經乙酰化修飾后，乙酰基作為被引入基團在紅外光譜中會表現出強烈的特征吸收。通常，乙酰化多糖具有以下紅外結構特征：3 400~3 300 cm-1處的寬吸收峰由O—H 單鍵的伸縮振動產生；3 000～2 800 cm-1處的吸收峰則為C—H 單鍵的伸縮振動，上述吸收峰是糖類化合物的特征吸收峰；1 735~1 725 cm-1之間則會出現引入乙酰基所產生的C=O 伸縮振動吸收峰，且在1 250 cm-1左右存在較弱的酯基C—O 單鍵伸縮振動，在1 735~1 725 cm-1處的吸收峰隨乙酰化取代度的增加而顯著增強，則說明乙酰化取代的成功[20]。Wang等[27]發現，乙酰化修飾的龍須菜多糖在1 733 cm-1附近出現了更加強烈的羰基吸收峰，表明乙酰化的成功。Yang 等[14]對乙酰化羊肚菌多糖進行檢測發現，經乙酰化修飾后，羊肚菌多糖在1 738.65 cm-1處出現新的C=O吸收峰，且在1 248.93 cm-1處的吸收峰顯著增強，判斷乙酰化修飾成功。

2.2 氫核磁共振和碳核磁共振

核磁共振同樣是鑒定多糖結構的可靠方法與手段[28]，常通過下列信息確認乙酰化修飾：氫核磁共振（hydrogen nuclear magnetic resonance，1H-NMR）中會出現δ 1.8~2.2 ppm 的甲基質子信號；碳核磁共振（carbon-13 nuclear magnetic resonance ，13C-NMR）中則會在δ 20~22 ppm 處出現乙酰基中甲基碳的信號，同時δ 170~180 ppm 處也會出現乙酰基的羰基信號。Gu 等[29]在500 MHz 條件下，對乙酰化麥冬多糖進行核磁共振掃描，在13C-NMR 結果中，174~176 ppm 處的羰基碳信號和20~22 ppm 處的甲基碳信號表明乙酰化修飾的成功。Li 等[30]對乙酰化青錢柳葉多糖進行檢測，在氫核磁共振中出現2.04 ppm 的化學位移，判斷為乙酰基上甲基的質子信號，碳核磁共振中175 ppm 處的化學位移信號歸屬為乙酰基上的羰基碳，21.5 ppm 處的化學位移信號歸屬為乙酰基上的甲基碳，由此判斷乙酰化修飾成功。

2.3 高效凝膠滲透色譜法和高效液相色譜法

高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法在確定多糖結構中具有重要的作用[31-32]。一方面，HPGPC 與HPLC 可以配合示差折射光檢測器確定多糖的相對分子質量，較為直觀地確定多糖在乙酰化過程中的降解程度。另一方面，多糖經過衍生化水解后，利用高效液相色譜測定衍生化多糖與標準品的保留時間、峰面積等參數，可以確定多糖的單糖組成[30]。Gu 等[29]利用HPGPC 測定了乙酰化前后麥冬根半乳聚糖的相對分子質量，經修飾，麥冬根半乳聚糖的相對分子質量由16.1 kDa 下降至8 kDa，表明乙酰化過程中存在降解。Li 等[33]以0.05 mol/L 磷酸二氫鉀-乙腈溶液為流動相，在1.0 mL/min 的流速、檢測溫度為30 ℃的條件下，利用HPLC 得到了乙酰化平菇菌絲體多糖的單糖組成。

2.4 掃描電子顯微鏡法

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）是明確多糖微觀結構特征的常用技術[34]，可以觀察多糖的微觀結構和分支狀態，通過比較不同多糖顆粒之間在超微形貌上的差異，可以得到分子粒徑、表面光滑程度、顆粒狀態等重要信息。Nuerxiati 等[35]利用SEM 對虎耳草多糖及其衍生物進行觀測，結果顯示，經過不同化學方法修飾后的虎耳草多糖在微觀結構上發生了相當程度的變化，由于引入了新的基團，多糖分子間距和孔徑都有所增加。Xiao 等[36]在觀測瑞士乳桿菌胞外多糖及其衍生物的超微結構后發現，由于劇烈的反應條件和引入基團的不同，一些衍生化多糖產生了斷裂、變形，表現為無定形的狀態。

2.5 乙酰化取代度的確定

多糖的乙酰化取代度，多采用羥胺比色法確定，其原理為在強堿條件下，乙酰化后的多糖會游離出乙酰基，與羥胺反應生成乙酰肟羥酸，再與Fe3+生成可溶性紅色絡合物羥肟酸鐵，即可利用吸光度測定取代度。Zhang 等[37]采用該方法測定了緣管滸苔多糖和不同乙酰化衍生多糖的乙酰化取代度，結果顯示，未修飾的多糖取代度為0，經過不同程度修飾后，取代度逐漸增加，表明乙酰化修飾的成功。此外，酸堿滴定法同樣可以計算多糖的乙酰化取代度，利用過量的強堿將乙酰化多糖堿解，以酚酞為指示劑，滴定堿解反應中過量的堿，即可得出乙酰化多糖的取代度。Sánchez-Rivera等[38]利用KOH 堿解乙酰化玉米淀粉和香蕉淀粉，利用HCl 進行滴定，確定了兩種乙酰化多糖的取代度。

3 乙酰化多糖的降糖活性作用機制

3.1 抑制糖代謝相關酶的活性

膳食淀粉被α-淀粉酶消化成麥芽糖、糊精和短鏈寡糖，隨后可被α-葡萄糖苷酶轉化成葡萄糖，從而提高餐后血糖水平，這與一些代謝性疾病息息相關[39-40]。因此，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶中的一種或兩種可以有效調節糖代謝，從而使相關藥物產生降糖活性。李順峰等[41]制備了乙酰化香菇柄多糖，對其檢測后發現，乙酰化香菇柄多糖表現出更強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且具有劑量依賴性。杜澤飛[42]對滇黃精多糖進行乙酰化修飾，共獲得3 種不同取代度的乙酰化多糖，且3 種多糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性均顯著提升，表現出較好的體外降糖活性。此外，劉阿娟等[43]也發現乙酰化修飾增強了虎奶菇菌核多糖的體外降糖活性，表明乙酰化修飾在多糖發揮降糖活性方面具有一定的研究價值。

3.2 維持胰島β 細胞功能正常

胰島β 細胞是維持機體糖代謝平衡的重要細胞，其功能退化和質量惡化是導致Ⅱ型糖尿病的重要因素[44-45]。研究表明，胰腺癌和慢性胰腺炎會通過阻礙胰島β 細胞的正常功能發揮，導致胰源型糖尿病和Ⅱ型糖尿病[46]。因此，預防和抵抗胰腺癌的發作，保護胰島β 細胞免受損害，是研究降糖活性的重要方向。Gu等[29]用乙酰化麥冬根半乳聚糖干預BxPC-3 和PANC-1兩種胰腺癌細胞，研究表明，乙酰化麥冬根多糖上調了癌細胞的p53、p21、FasL和Bax等相關細胞凋亡基因的表達，激活了caspase-3 蛋白酶的活性，從而誘導胰腺癌細胞的凋亡。李銀莉[47]發現，經乙酰化馬齒莧多糖處理INS-1 細胞后，在一定濃度范圍內，乙酰化馬齒莧多糖有效促進了細胞增長，進一步刺激了INS-1 細胞的合成和胰島素的分泌，并提高了PDX-1 和GLUT-1的蛋白表達量，展現出較好的胰島β 細胞保護能力以及良好的開發前景。

3.3 雙向調控免疫活性

免疫是維持機體內穩態平衡的重要生理功能，巨噬細胞在其中發揮著重要的作用。活化后的巨噬細胞可以直接吞噬病原體，并產生炎癥細胞因子來進一步激活免疫反應，消滅入侵機體的病原體[48-49]。但同時，過度活化的巨噬細胞會產生大量的炎癥細胞因子，阻礙機體恢復健康，并誘發如糖尿病、高脂血癥等慢性疾病[50-51]。而部分乙酰化多糖可以雙向調控免疫活性，不僅可以作為免疫調節劑增強免疫活性，還可以在免疫反應過強、導致炎癥發生時發揮抑制作用。Yang等[14]得到3 種不同取代度的乙酰化羊肚菌多糖，一方面測定了乙酰化羊肚菌多糖對RAW264.7 細胞的免疫增強效果，另一方面用脂多糖誘導RAW264.7 細胞形成炎癥模型，采用3 種乙酰化多糖作為抗炎劑干預，結果表明，羊肚菌多糖和乙酰化羊肚菌多糖通過NF-κB和p38/MAPK 信號傳導通路發揮明顯的免疫調節作用，可促進RAW264.7 巨噬細胞的細胞增殖、吞噬作用，增加NO 的產生和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌。與羊肚菌多糖相比，乙酰化羊肚菌多糖進一步增強了RAW264.7 細胞的增殖活性和NO 的產生。此外，在脂多糖誘導的炎癥反應模型中，乙酰化羊肚菌多糖表現出更強的抑制作用。

3.4 改善機體氧化應激

氧化應激是機體內氧化與抗氧化的失衡態，會使得生物體的一些重要的大分子物質與活性氧發生反應，進而失去原有的生理活性，最終導致細胞損傷與凋亡[52-53]。當代藥理學表明，氧化應激是導致機體糖代謝異常、逐步發展成糖尿病的重要原因。一方面，胰島β 細胞自身會生成大量內源性活性氧，且自身抗氧化能力較差，易受氧化損傷，影響胰島素的分泌[54]；另一方面，大量產生的活性氧會與炎癥細胞因子一同促進肝臟和外周組織的胰島素抵抗，致使糖耐量受損[55]。近年來，抗氧化作為調節糖代謝紊亂的重要途徑而備受關注，Ma 等[56]測定了乙酰化樺褐孔菌多糖的體外抗氧化活性，以鐵還原力測定試驗和大鼠肝臟脂質過氧化抑制實驗的結果為指標，驗證了乙酰化樺褐孔菌多糖具有更強的體外抗氧化活性。Zhang 等[57]在此基礎之上，以乙酰化龍須菜多糖為研究對象，測定了其還原力活性和總抗氧化活性，對比發現，乙酰化后的多糖對一些自由基有著很強的清除活力，有望日后進一步開發應用。

3.5 充當益生元，改善腸道菌群

隨著對機體糖代謝的不斷深入研究，腸道菌群改變而導致糖尿病的發生成為新的研究方向。目前認為，肥胖所致腸道菌群的改變，是引發胰島素抵抗，并進一步發展為糖尿病的關鍵[58-59]。研究表明，部分多糖具有益生元作用，可以刺激機體腸道內益生菌的繁殖、調節腸道微環境、維護腸道pH 值穩定[60]。腸道乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌的減少與葡萄糖耐量異常密切相關，這可能影響葡萄糖和能量的吸收，同時促進脂肪的合成和儲存，進而參與糖尿病的發生發展[61]。Nuerxiati 等[35]對虎耳草多糖進行乙酰化修飾，并對保加利亞乳桿菌和青春雙歧桿菌的增殖進行干預，結果發現，虎耳草多糖對其增殖不產生明顯效果，而乙酰化虎耳草多糖可明顯促進保加利亞乳桿菌和青春雙歧桿菌的增殖，表明乙酰化虎耳草多糖具有充當益生元的潛力。

4 結語與展望

糖尿病發病率逐年上升，嚴重阻礙我國醫藥衛生事業的健康發展，尋找低毒高效的新藥，深受廣大科研工作者的關注。多糖作為備受矚目的天然活性物質，經乙酰化修飾后，能夠有效增強生物活性、改善其生物調節作用，在一定程度上降低副作用甚至產生新的活性。

目前，國內外學者對多糖的乙酰化修飾及其降糖活性機制已有一定研究，但仍存在一些問題亟待解決：1）乙酰化多糖的結構特征與其發揮降糖活性作用之間的內在聯系并未得到明確闡釋，包括三螺旋結構、多糖微粒表面光滑程度、黏度特性等因素對其發揮降糖作用的影響；2）多糖的乙酰化修飾過程由于反應進度、取代位點等因素的不可控，致使乙酰化修飾過程并不具有明確的規律性和普適性，不同多糖的降糖活性也并不完全相似。因此，仍需確定具有較好規律性的乙酰化修飾方法；3）乙酰化多糖的單糖組成、相對分子質量、修飾位點等一級結構的研究已有報道，但作為大分子物質，其高級結構的研究鮮見，有必要開展乙酰化多糖的分子結構、空間構型、構效關系等方面的研究；4）多糖乙酰化修飾的毒性考察較少，且多數為細胞毒性試驗，并未針對其進行長期療效和毒性觀察，有必要開展和完善安全性和毒理學方面研究；5）乙酰化多糖的降糖作用機制尚不明確，具體的分子機制、信號通路等生化、基因水平的作用途徑的機制仍需進一步深入研究。

綜上，多糖的乙酰化修飾作為開發利用多糖的重要手段，能夠提升多糖在食品和生物醫藥領域的價值，仍有待于深入研究。在未來的研究中，針對上述問題，確定多糖乙酰化修飾的定量反應、明確乙酰化多糖的構效關系和降糖作用機制、闡釋乙酰化多糖的高級結構將成為研究多糖乙酰化修飾的主要研究方向，以期為更加高效準確應用乙酰化多糖、開發降糖藥物提供參考。