實時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中的應(yīng)用價值分析

梁潔瓊，黃雪萍，胡斌，寧梅芳

1.來賓市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣西來賓 546100；2.來賓市人民醫(yī)院兒科，廣西來賓 546100

支原體肺炎是由支原體感染引起的疾病，作為兒童最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一[1]。支原體肺炎感染人體后經(jīng)過2～3 周潛伏期，此時在臨床表現(xiàn)為干咳、發(fā)熱、咽痛、頭痛等，甚至部分患兒無明顯癥狀，且該病可通過飛沫和直接接觸傳播，因此易在人群密集環(huán)境中發(fā)生[2]。統(tǒng)計顯示，近年隨著空氣環(huán)境、飲食習(xí)慣等的變化，該病發(fā)生率持續(xù)升高，若未及時治療可引起腦膜炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患兒身心健康狀態(tài)[3]。既往針對支原體肺炎以血清中檢測出的支原體抗體為主要依據(jù)，但經(jīng)血清免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，支原體等微生物進(jìn)入人體后需要一定時間引起免疫應(yīng)答繼而產(chǎn)生抗體，因此血清支原體抗體在支原體感染診斷中存在一定漏診[4]。近年隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及臨床對分子生物學(xué)研究的不斷深入，實時實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床，為深入分析該方案在支原體肺炎診斷中的價值，本文選取2022 年8 月—2023 年10 月來賓市人民醫(yī)院收治的1 200 例疑似支原體肺炎患兒為研究對象，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的1 200 例疑似支原體肺炎患兒為研究對象，分別采集其血清和呼吸道分泌物，用化學(xué)發(fā)光法測定血清中肺炎支原體抗體，用實時熒光PCR 法檢測呼吸道分泌物中的肺炎支原體核酸（Mycoplasma Pneumoniae Nucleic Acid，MP-DNA）。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)1 200例患兒中男684例，女516例；年齡1～12歲，平均（5.14±0.82）歲；入院原因：發(fā)熱841例，干咳197 例，頭痛162 例；癥狀出現(xiàn)時間1～22 d，平均（10.41±1.42）d。本研究上報醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會并獲得審批。同時經(jīng)患兒家屬知情同意（LW2023-02）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①存在干咳、發(fā)熱、咽痛、頭痛等癥狀，且符合《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡1～12 歲；③臨床各項資料齊全；④本研究患兒家屬知情，并簽署知情同意書；⑤未采取免疫抑制劑或免疫增強藥物治療；⑥無臟器組織損傷；⑦急性期及恢復(fù)期雙份血清抗體滴度呈4倍及以上升高；⑧入院24 h 內(nèi)支原體抗體（Mycoplasma Antibody）MP-Ab≥1∶160。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①自愿退出本次研究者；②入院前2周使用阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療者；③入院后治療中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)者；④病歷資料不完善者；⑤混合病原菌感染者；⑥未按要求完成隨訪者；⑦先天性免疫缺陷者；⑧營養(yǎng)不良者。

1.3 方法

1 200 例患兒均采集其血清和呼吸道分泌物，用化學(xué)發(fā)光法測定血清中肺炎支原體抗體，用實時熒光PCR 法檢測呼吸道分泌物中的MP-DNA，在實施檢查前為患兒及其家屬講解具體檢查流程、注意事項等，同時告知其標(biāo)本采集過程中注意事項，確保其積極配合。

MP 血清學(xué)方法檢測：血清標(biāo)本采集患兒的靜脈全血2～3 mL 于無菌生化管中，并分離出血清待檢，化學(xué)發(fā)光法肺炎支原體抗體檢測試劑盒由亞輝龍生物科技股份有限公司提供，儀器使用亞輝龍ICERSiFlash 3000-C 化學(xué)發(fā)光測定儀，檢測結(jié)果判定：抗肺炎支原體IGM 抗體（Anti Mycoplasma Pneumoniae IGM, MP-IGM）結(jié)果在0.9～1.1 coI 時，為可疑感染；MP-IGM 結(jié)果＞1.1 coI 時，為陽性，提示患兒處于肺炎支原體急性感染期。

實時熒光PCR 檢測：標(biāo)本采集要求為鼻咽拭子（雙拭子）：用一次性鼻拭子經(jīng)由患兒鼻腔輕輕旋轉(zhuǎn)一周，將采集好的拭子頭垂直插入標(biāo)本采集管中，同時用一次性咽拭子經(jīng)由患兒的咽喉后壁、扁桃體側(cè)壁等處反復(fù)擦拭2～3 次，將采集好的拭子頭垂直插入同一標(biāo)本采集管中密封待檢。熒光PCR 法肺炎支原體核酸檢測試劑盒由圣湘生物科技股份有限公司提供，本試劑盒的最低檢測下限為500.0 copies/mL；儀器為上海宏石SLAN-96P 實時熒光定量PCR 儀，擴(kuò)增條件設(shè)置為50℃，30 min，1 個循環(huán)，95℃，1 min，1 個循環(huán)，95 ℃，15 s、60 ℃，30 s、45 個循環(huán)，25℃，10 s，1 個循環(huán)，熒光通道選擇FAM 、VIC 通道。陽性結(jié)果：動力學(xué)曲線呈“S”型，F(xiàn)AM 通道Ct 值≤40，且VIC（內(nèi)標(biāo)通道）≤40；陰性結(jié)果：FAM通道Ct 值＞40， VIC（內(nèi)標(biāo)通道）動力學(xué)曲線呈“S”型，且VIC（內(nèi)標(biāo)通道）Ct 值≤40；對于陽性標(biāo)本，內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果不作要求；對于陰性樣本，其內(nèi)標(biāo)檢測應(yīng)為陽性（Ct 值≤40），若其內(nèi)標(biāo)Ct 值＞40 或無顯示，則該樣本的檢測結(jié)果無效，應(yīng)查找并排除原因，并對此樣本重新采樣，進(jìn)行重復(fù)試驗。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 診斷結(jié)果 以病原學(xué)檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析各個方案結(jié)果。

1.4.2 診斷效能 分析各個方案診斷效能，靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）×100%，陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%。準(zhǔn)確度=（真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計方法

以SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料（診斷效能值）采用例數(shù)（n）和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法診斷結(jié)果對比

以病原學(xué)檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，支原體肺炎陽性939 例，陰性261 例。見表1。

表1 兩種方法診斷結(jié)果對比（n）

2.2 兩種方法診斷效能對比

實時熒光PCR 檢測靈敏度（99.36%）、特異度（98.08%）、準(zhǔn)確率（99.08%）、陽性預(yù)測值（99.36%）、陰性預(yù)測值（98.08%）高于MP 血清學(xué)方法檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩種方法診斷效能對比（%）

3 討論

支原體肺炎是除病毒、細(xì)菌外極易引起兒童肺炎的常見病原體，在全球范圍內(nèi)每年均有支原體肺炎感染病例報告，且呈現(xiàn)持續(xù)、散發(fā)或不定期的特征。支原體肺炎的傳染率較高，多在中小學(xué)、幼兒園等相對封閉的場所暴發(fā)，加之該病無特異性癥狀，多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰等，因此，漏誤診率較高，若未及時控制隨著病情加重可誘發(fā)肺外感染、心力衰竭、全身炎癥反應(yīng)等，威脅患兒生命[6-9]。

肺炎支原體缺乏細(xì)胞壁，用針對抑制細(xì)胞壁合成發(fā)揮抗菌作用的頭孢菌素類、β 內(nèi)酰胺類抗生素治療支原體肺炎是無效的，而大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的抗菌機制是控制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，因此大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療支原體肺炎效果理想，故及早實施診斷對制訂治療方案有重要作用[10-11]。

本研究顯示，實時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中效果理想[11]。MP 血清學(xué)方法具有操作簡單、速度快等特點，但其靈敏度、特異度較低，極易出現(xiàn)假陽性的情況。實時熒光PCR 檢測技術(shù)是一種新興的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，可同時擴(kuò)增多個標(biāo)本，直接反映患兒的感染情況，該方法可通過探針實時監(jiān)測擴(kuò)增時的熒光信號，不必進(jìn)行電泳等操作，可縮短檢測所需時間，同時可提高診斷準(zhǔn)確率，但需要注意該方案對樣本采集和操作環(huán)境要求較高，若樣本處理出現(xiàn)差錯可直接影響診斷結(jié)果，增加診斷難度，因此臨床需要對操作人員綜合能力進(jìn)行培養(yǎng)[12-15]。

本研究顯示，實時熒光PCR 檢測靈敏度（99.36%）、特異度（98.08%）、準(zhǔn)確度（99.08%）、陽性預(yù)測值（99.36%）、陰性預(yù)測值（98.08%）高于MP 血清學(xué)方法檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），該結(jié)果與王晶等[16]研究中RTFQ-PCR 診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為90.48%、93.02%、95.00%、89.96%，這一結(jié)果接近，可見支原體肺炎診斷中應(yīng)用實時熒光PCR 檢測可行性較高，究其原因在于實時熒光PCR 檢測是唯一一個將基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量的方法，且檢驗操作較為智能，可減少人工誤差；其次該方案特異度、靈敏度較高，將DNA 雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精準(zhǔn)性融合，應(yīng)用熒光探針和光電傳導(dǎo)，直接探測基因擴(kuò)增過程中熒光信號的變化，以獲得定量結(jié)果，相當(dāng)于在PCR 反應(yīng)過程中自動完成了Northern 雜交，杜絕了傳統(tǒng)PCR 開放檢測對環(huán)境的污染和由此導(dǎo)致的假陽性，提高診斷準(zhǔn)確率[17]。

綜上所述，實時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中的應(yīng)用價值較高，臨床醫(yī)師可結(jié)合診斷結(jié)果制定合理的干預(yù)方案，達(dá)到控制病情改善預(yù)后的目的。