高良姜二苯庚烷化合物對3T3- L1 前脂肪細胞分化的影響和機制研究

周春仲，鄭偉清，袁曉怡，歐志堅，姜一平

珠海市人民醫院·暨南大學附屬珠海醫院藥學部，廣東珠海 519000

異常的脂肪代謝細胞增殖和分化導致脂肪細胞分泌，繼而產生代謝性疾病。因此，脂肪細胞已經成為代謝疾病的藥物靶點[1]。高良姜是一種具有抗氧化、抗腫瘤和抗凝等作用的植物，高良姜中的二苯庚烷化合物是天然的抗氧化劑，可減輕氧化應激對細胞和組織的損傷，并具有抗菌活性的作用，也能減輕消化道炎癥和潰瘍[2]。相關研究顯示，二苯庚烷類化合物在抗炎、抗病毒和抗腫瘤等方面表現出良好的效果[3-4]。然而，高良姜是否參與脂肪細胞增殖和分化過程，目前尚無相關研究。因此，本研究選取2022 年9 月—2023 年2 月珠海市人民醫院·暨南大學附屬珠海醫院3T3-L1 前脂肪細胞為研究對象，觀察高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的影響，同時分析其作用機制，以期在細胞水平上為肥胖和代謝性疾病的作用機制提供參考價值。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

細胞培養基：DMEM 高糖培養基（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美國），含有10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）和1% 青霉素/鏈霉素（Penicillin-streptomycin）。高良姜二苯庚烷化合物，規格：純度≥98%，1 mg，購自Sigma-Aldrich，美國。

①細胞：選用3T3-L1 前脂肪細胞（ATCC，美國）為模型，細胞規格：ATCC 號-CL-173?，用于抗肥胖活性成分篩選。

②試劑：MTT 試劑（規格：5 g）（Sigma-Aldrich，美國）、油紅O 染色溶液（規格：10 g）（Sigma-Aldrich，美國）、4% 甲醛固定液（規格：500 mL）（Sigma-Aldrich，美國）、60%異丙醇（規格：500 mL）（Sigma-Aldrich，美國）、85%異丙醇（規格：500 mL）（Sigma-Aldrich，美國）、PBS（規格：500 mL）（Gibco，ThermoFisherScientific，美國）、96 孔板（Corning，美國）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1 前脂肪細胞培養 在細胞培養板中接種3T3-L1 前脂肪細胞，并在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。將細胞均勻分配到96 孔板中，每個孔約應含有1×104個細胞。

1.2.2 高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1 增殖的影響 在培養皿中培養3T3-L1 前脂肪細胞，使用DMEM 培養基，含有10% 胎牛血清，并在37℃、5%CO2的條件下培養至細胞適當的生長狀態。當細胞生長至60%～65%融合時移動到96 孔板中，更換無血清的培養基培養24 h 后，分別添加含有高良姜二苯庚烷化合物不同濃度（0、0.05、0.2、0.4 g/L）的培養基，并在37℃、5%CO2的細胞培養箱中繼續培養。使用吸頭抽取培養基并加入MTT 試劑檢測細胞的增殖情況，將MTT 試劑加入到每個孔中，每孔添加20 μl 的5 mg/mL MTT 溶液，繼續孵育細胞4 h，使MTT 在細胞中代謝為紫色產物。抽取MTT 試劑，并加入150 μL 甲醇溶解產物，使用振蕩器輕輕震動，使產物充分溶解。最后，使用酶標儀，設置波長為570 nm，測量每個孔的吸光度值。

1.2.3 高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1 分化的影響 在細胞培養板中接種3T3-L1 前脂肪細胞，并在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，對細胞進行分化誘導，添加分化誘導劑地塞米松，促使細胞分化成脂肪細胞。使用PBS 洗滌細胞，去除殘留培養基。加入4%甲醛固定液，固定細胞，固定時間通常為15 min。使用60%異丙醇脫水，使細胞逐漸脫水。加入油紅O 染色溶液，覆蓋固定的細胞，讓染色溶液充分滲透。使用85%異丙醇洗去多余的染色溶液。在顯微鏡下觀察染色后的細胞，脂肪滴會呈現橙紅色。可以拍攝圖片以備后續分析。

1.2.4 空白對照組加入等量無菌生理鹽水 設立空白對照組，加入等量的無菌生理鹽水到培養基中。保持無菌生理鹽水與其他處理劑的加入體積相同，以確保實驗的一致性。將含有無菌生理鹽水的細胞培養基加入到空白對照組的細胞培養板中，使細胞暴露于無菌生理鹽水處理。繼續培養細胞至24 h。

1.3 統計方法

采用SPSS 28.0 統計學軟件分析數據，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度高良姜二苯庚烷化合物對不同時間點3T3-L1 增殖影響比較

高良姜二苯庚烷化合物濃度為0.2g、0.4 g/L 時3T3-L1 增殖高于與對照組，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度高良姜二苯庚烷化合物對不同時間點3T3-L1 增殖(OD570)影響比較（±s）

表1 不同濃度高良姜二苯庚烷化合物對不同時間點3T3-L1 增殖(OD570)影響比較（±s）

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2.2 高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1 分化影響分析

高良姜二苯庚烷化合物處理組的細胞中脂肪滴數量較少，顏色較淡，相比之下，對照組的細胞中脂肪滴數量較多，顏色較深。

2.3 高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1 分化相關基因PPARγ 和C/EBPαmRNA 表達影響比較

高良姜二苯庚烷化合物處理組在脂肪細胞分化的早期階段和中后期階段的PPARγ 和C/EBPα 的mRNA 表達水平均呈現下調趨勢。隨著高良姜二苯庚烷化合物濃度的增加，這種下調趨勢逐漸增強。特別是在100 μmol/L 處理組，PPARγ 和C/EBPα 的mRNA 表達水平顯著降低。見圖1。

圖1 高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1 分化相關基因PPARγ 和C/EBPαmRNA 表達的影響

3 討論

脂肪組織是由脂肪細胞組成，其主要功能是能量儲存和釋放，同時也是內分泌器官，內分泌功能產生多種脂肪激素調節代謝平衡[5-6]。然而，若脂肪組織過度激烈或功能紊亂，導致一系列代謝疾病。肥胖是與脂肪組織紊亂相關的常見代謝性疾病，典型癥狀為脂肪組織過度堆積，體質量增加和體質指數（body mass index, BMI）也隨之升高[7-8]。2型糖尿病是脂肪細胞分泌的激素失調導致胰島素抵抗和胰島素分泌不足，影響血糖調節[9]。高脂血癥是脂肪代謝紊亂的結果，與脂肪組織中的脂質代謝失衡密切相關[10-11]。

高良姜含有豐富的姜辣素和揮發油等生物活性成分，具有溫陽散寒和活血化瘀的作用，廣泛應用于中醫藥治療寒濕痹阻和瘀血癥狀等[12-13]。臨床相關研究表明，高良姜中的活性成分具有抗腫瘤、調節血糖和血脂等作用[14-15]。高良姜中的二苯庚烷化合物代表的藥物是姜黃素，許多研究表明，姜黃素抗氧化能力，能夠中和自由基，降低氧化應激對細胞和組織的損傷[16-17]。

本研究結果顯示，高良姜二苯庚烷化合物濃度為0.2、0.4 g/L 對3T3-L1 增殖的影響，說明高良姜二苯庚烷化合物可促進前脂肪細胞的增殖。高良姜二苯庚烷化合物通過抑制3T3-L1 細胞的增殖，且通過調節細胞周期進程、促進細胞凋亡或抑制細胞增殖相關信號通路，促進3T3-L1 細胞向脂肪細胞的分化[18]。郭莉霞等[18]研究將1、10 μmol/L 新橙皮苷作用于3T3-L1 前脂肪細胞誘導分化，新陳皮苷抑制分化率達到25%，提示新陳皮苷抑制3T3-L1前脂肪細胞誘導分化，本研究結果與其相似。本研究結果顯示：高良姜處理組OD570值與對照組比較，提示高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1 前脂肪細胞分化產生抑制的作用。脂肪細胞的增殖與分化過程中是復雜的生物學過程，其中PPARγ（過氧化物酶體增殖物活化受體γ）和C/CBPαmRNA（CCAAT/增強子結合蛋白α）在其中起著重要的調控作用[19]。高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1 分化相關基因PPARγ 和C/EBPα 的mRNA 表達產生的影響主要是促進它們的表達，從而促進3T3-L1 細胞向脂肪細胞分化[20]。高良姜二苯庚烷化合物通過調節轉錄因子的表達和活性，增加PPARγ 的表達水平，從而增強3T3-L1 細胞向脂肪細胞的分化。除了促進PPARγ 的表達外，C/EBPα（CCAAT/增強子結合蛋白α）是另一個關鍵的轉錄因子，它也參與調控脂肪細胞分化的過程[21]。本研究中，100 μmol/L 處理組，PPARγ 和C/EBPα 的mRNA 表達水平顯著降低，提示高良姜二苯庚烷化合物抑制了PPARγ 表達，從而對3T3-L1 前脂肪細胞分化起到抑制作用。

綜上所述，高良姜二苯庚烷化合物對3T3-L1前脂肪細胞分化明顯抑制，調控PPARγ 等表達量，本研究發現高良姜二苯庚烷化合物在肥胖的預防治療中具有一定的價值。