鐵死亡在甲狀腺癌發生發展及治療中的研究進展

田宏友，任艷，程璐，馬家驤，郭琎祎，宋愛琳

1 蘭州大學第二醫院普通外科，蘭州 730030；2 蘭州大學第二臨床醫學院

甲狀腺癌（TC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤，據GLOBOCAN 2020 數據顯示［1］，全球TC 的新發病例數約58.6 萬。我國TC 發病率較高［2］，并且以每年20%的速度增加［3］。TC依據腫瘤的起源和分化程度不同可分為以下4 類：分化型甲狀腺癌（DTC）、甲狀腺低分化癌（PDTC）、甲狀腺未分化癌（ATC）和甲狀腺髓樣癌（MTC）［3］。盡管多數DTC 經過標準治療［手術后輔以131I 治療和（或）TSH 抑制治療］后預后良好，但仍有10%的患者會發生遠處轉移，2/3 的此類患者可發展為預后不良的碘難治性DTC，10 年生存率不到10%［4］。ATC 是預后最差的TC，中位生存期約5 個月，1 年總生存率為20%［5］。PDTC 在形態學、生物學和預后介于DTC 與ATC 間［3］。MTC 的侵襲性較DTC 強，對于術后血清降鈣素倍增時間位于6～24個月與小于6個月的患者相比，10年生存率從37%降至8%［6］。基于目前TC 的臨床治療數據顯示部分患者的生存率降低，故有必要進一步探索TC的新型分子機制和治療方法。鐵死亡是一種新型鐵依賴性的程序性細胞死亡，核心特征是細胞內積聚過量的脂質活性氧（ROS）和獨特的線粒體形態結構變化，包括體積減小、嵴減少或消失、膜密度增加。鐵死亡誘導因子通過多種途徑來耗竭細胞內的谷胱甘肽（GSH）、降低谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的活性和增加細胞內游離鐵的含量，誘導細胞產生大量的脂質ROS，導致細胞發生鐵死亡。該過程的調控途徑大致分為以下3 類：GSH/GPX4 通路，主要包括抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉運體（System Xc-）和GPX4；脂質代謝途徑，長鏈酯酰輔酶A 合成酶4 的正向調節；鐵代謝途徑，正向調控鐵效應元件結合蛋白2 表達等。鐵死亡相關的實驗試劑（如Erastin）、獲批藥物（如索拉非尼）、電離輻射和細胞因子（如IFNγ）均可高效誘導細胞發生鐵死亡并抑制多種腫瘤生長，已成為目前治療侵襲性惡性腫瘤的研究熱點［7］。近年來，鐵死亡在TC 中的研究取得一系列進展，現將其在TC發生發展及治療中的研究進展綜述如下。

1 鐵死亡調節因子在甲狀腺癌發生發展中的作用

1.1 溶質載體家族7成員11（SLC7A11） SLC7A11是System Xc-的活性功能單位，對細胞外胱氨酸的攝取起決定性作用，攝入細胞內的胱氨酸經NADPH的作用還原為半胱氨酸，后者依次在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的作用下合成GSH。GSH 是細胞內最豐富的抗氧化劑，GPX4 利用GSH將累積的膜脂質氫過氧化物還原為脂醇，從而抑制細胞的鐵死亡［8］。目前關于影響SLC7A11下調并促進TC 鐵死亡的證據已明確，包括E26特異性轉化變異體4（ETV4）敲低和脂肪量和肥胖相關蛋白（FTO）的過表達，兩者均為SLC7A11 的上游調節因子。最近一項關于ETV4 調控SLC7A11 的研究顯示，ETV4在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）細胞和組織中高表達，在體外實驗中發現ETV4 與SLC7A11 水平呈正相關，通過敲低ETV4 可直接促進SLC7A11 途徑上的鐵死亡，從而抑制細胞的增殖活力，后續的PTC異種移植小鼠體內實驗進一步驗證了該途徑的真實性［9］。此外，FTO 作為調節SLC7A11 的又一重要靶點，與ETV4的不同點：首先，FTO 在PTC 組織中表達下調；其次，FTO不可直接調控SLC7A11的轉錄，只能調節經N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化修飾的SLC7A11；最后，FTO 與SLC7A11 的水平呈負相關，即高表達的FTO 通過抑制SLC7A11 的m6A 修飾并下調該分子表達，從而促進PTC發生鐵死亡，抑制腫瘤的生長和進展［10］。

1.2 GPX4 GPX4是一種硒酶，亦是鐵死亡上游的關鍵還原調節劑，具有將GSH 轉化為氧化型谷胱甘肽和磷脂氫過氧化物還原為相應脂醇的雙重作用，從而防止脂質ROS 的累積，產生抑制鐵死亡的作用［7］。泛素特異性蛋白酶10 具有致癌活性，可通過上調 SIRT6 水平來促進 GPX4 的表達，進而抑制PTC 細胞發生鐵死亡［11］。在探究維生素C 如何影響ATC 的鐵死亡中發現，高劑量的維生素C 通過降低ATC 細胞中GPX4 表達，具有抑制癌細胞的生長作用，而鐵死亡抑制劑能顯著逆轉該抑制作用，表明GPX4 抑制是激活ATC 鐵死亡的關鍵條件［12］。RAS選擇性致死分子3（RSL3）是GPX4的直接抑制劑，不受GSH 的影響，當RSL3 以不可逆的方式與GPX4 的活性位點 Sec46結合后，導致GPX4 失活并引發脂質ROS 累積，促進細胞發生鐵死亡［13］。SEKHAR 等［14］研究RSL3 與TC 鐵死亡的關系時發現，TC 細胞經RSL3試劑處理后，其GPX4蛋白表達降低，而脂質過氧化物顯著增加和ROS 水平呈濃度依賴性上升，鐵死亡標志物（轉鐵蛋白受體1）的表達明顯增加。二芳基醚衍生物16 與GPX4 的結合位點不同于RSL3，通過結合GPX4 的Thr49來抑制其活性，進而誘導ROS 產生來降低TC 細胞的GSH 水平、線粒體膜極化和呼吸能力，促進細胞的鐵死亡［13］。因此，抑制GPX4的活性是鐵死亡發生的核心標志。

1.3 核因子E2 相關因子2（Nrf2） Nrf2 是是鐵死亡的負向調節因子，具有促進癌癥進展的作用，Nrf2激活可促進鐵的儲存，減少細胞鐵的攝取并限制ROS 的產生，抑制細胞的鐵死亡現象。甲基蓮心堿是鐵死亡的激活劑，一項關于甲基蓮心堿抑制TC進展的研究指出，Nrf2 在TC 細胞中高表達，可顯著提高Nrf2 蛋白表達和降低細胞的凋亡率，具有明顯促腫瘤作用，但TC 細胞經甲基蓮心堿處理后發現，Nrf2 蛋白表達顯著下降，而ROS 和Fe2+水平明顯增加，呈現出明顯的鐵死亡現象［15］。ALKBH5 已被報道可影響諸多腫瘤進展，ALKBH5 經m6A 修飾后可下調T 淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1 的mRNA 表達和降低Nrf2 蛋白水平，進而促進TC 細胞的鐵死亡，抑制腫瘤生長［16］。

1.4 血紅素加氧酶-1（HO-1） HO-1作為Nrf2抗氧化反應的下游靶基因，其活性增強可促進鐵蛋白（或血紅素）的降解并釋放鐵，后者通過芬頓反應產生大量脂質ROS，從而誘導細胞的鐵死亡并減少腫瘤的發生 。姜黃素具有潛在的抗癌效果，一項探究其抑制甲狀腺濾泡狀癌（FTC）細胞的鐵死亡機制表明，HO-1在FTC 組織和細胞中表達上調，在經不同濃度姜黃素處理的FTC 細胞中發現，高濃度的姜黃素可促進HO-1 蛋白表達，后者可下調GPX4 來增加細胞內鐵和脂質ROS，促進FTC細胞的鐵死亡［17］；毛蕊異黃酮（CA）與姜黃素的藥理作用不同，CA 通過降低HO-1蛋白表達來促進FTC 細胞的鐵死亡，從而抑制腫瘤進展，但HO-1激動劑可部分逆轉CA的功效［18］；表明HO-1在FTC細胞的鐵死亡中具有雙重角色，可能源于ROS 的生產量和線粒體氧化損傷程度存在差異。

2 鐵死亡相關非編碼RNA（NcRNA）在甲狀腺癌發生發展中的作用

NcRNAs 是一類可以轉錄但不能被翻譯成蛋白質的RNA，可通過作用于關鍵調控因子或上游靶點來影響腫瘤細胞的鐵死亡，目前在TC中的研究主要包括環狀RNA和長鏈非編碼RNA （lncRNA）。

2.1 環狀RNA 環狀RNA 是一類具有環狀結構的新型轉錄物，其調控異常與腫瘤進展顯著相關。環狀RNA Circ_0067934 是TC 細胞中上調的癌基因環狀RNA，自身可充當miR-545-3p（一種靶向下調SLC7A11 的miRNA）的海綿，與miR-545-3p 競爭性結合來抑制TC 的鐵死亡；此外，抑制Circ_0067934可增加TC 細胞對體內Erastin 的敏感性［19］。另一項關于環狀RNA 的研究指出，circKIF4A 能直接海綿miR-1231，并通過上調抗氧化蛋白GPX4 表達，促進PTC 進展。然而，敲除circKIF4A 可降低GSH/GSSG值和抑制腫瘤生長［20］。因此，環狀RNA 可通過調節鐵死亡作為治療TC的潛在靶點。

2.2 LncRNA LncRNAs 是一類長度超過200 個核苷酸的NcRNAs，通過表觀遺傳、轉錄和翻譯來調節基因表達。在PTC 組織和細胞中，LncRNA CERS6-AS1、LIM 和SH3 蛋白1（LASP1）均高表達，而 miR-497-5p 表達降低，深入機制研究發現， LASP1 由CERS6-AS1 通過海綿miR-497-5p 調節，上調LASP1或沉默miR-497-5p 可削弱CERS6-AS1 對PTC 細胞的增殖作用［21］。因此，下調CERS6-AS1 可通過調節miR-497-5p/LASP1 軸促進鐵死亡，此揭示了LncRNA在TC中的新發病機制和治療靶點。

3 鐵死亡在甲狀腺癌腫瘤微環境（TME）發生發展中的作用

TME 由腫瘤中的非癌細胞及其產生的分子和細胞外基質構成，其作為腫瘤細胞賴以生存的內部環境，影響腫瘤的發生、進展和治療反應。基于癌癥基因組圖譜（TCGA）、高通量基因表達數據庫（GEO）和FerrDb網站的數據，研究TC鐵死亡相關基因的免疫通路表明，鐵死亡與腫瘤TME 之間存在密切聯系。由于各基因對TC的致癌風險不一，因此總風險評分應根據LASSO 回歸算法處理，即總風險評分=∑e 各基因的表達水平×相應的回歸系數，由此可將患者按中位風險評分（總風險評分的中值作為分界點）分為高風險組和低風險組。目前研究顯示，高、低風險組患者TME 的免疫細胞組分差異較大，M0巨噬細胞、B細胞、T輔助細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞等見于高風險組，巨噬細胞M1 存在于低風險組，而樹突狀細胞、NK細胞、調節性T細胞、肥大細胞、CD4+T細胞等可見于兩者［22-26］。由于TME細胞組分的浸潤程度不一，導致免疫細胞評分和免疫功能評分存在一定差異。一項回顧性研究發現，PTC 的促瘤免疫細胞數量和百分比增加，高風險組的Ⅰ型干擾素反應、抗原呈遞細胞共刺激和主要組織相容復合體Ⅰ類等免疫途徑激活較低風險高，其免疫細胞評分和免疫功能評分較高，可通過增加腫瘤細胞的免疫抗性并最終導致免疫逃逸，促進PTC 的進展和降低患者無進展生存期［22］。但另外幾項研究與其相反，低風險組免疫細胞和免疫功能評分高，可抑制患者TC的進展和具有良好的總體生存期［23-26］。該現象發生的原因可能是某些主要免疫細胞在TC 中的浸潤及作用仍然不清楚和TME 各組分間的復雜相互作用，需進一步深入探究以尋求免疫新療法。

4 鐵死亡在甲狀腺癌治療中的作用

GPX4在TC的發生發展和惡性行為中起重要作用，RSL3 已被證明可有效對抗TC 細胞的惡性潛能［14］。深入探究RSL3 治療PTC 不同突變細胞系的療效發現，RSL3 抑制BRAF-TERT 共突變型細胞最有效，RAS 突變細胞次之，BRAF 突變細胞系最差。表明不同PTC 突變亞型細胞系對GPX4 抑制劑的敏感性存在差異，此為臨床治療PTC 不同的基因突變亞型提供了新依據［27］。RSL3 和Erastin 均可誘導FTC與ATC細胞的鐵死亡，但ATC細胞能下調CD71表達而對該途徑產生抵抗性，闡明CD71可視為ATC治療的新靶點［28］。人巰基白蛋白作為一種新發現的鐵死亡誘導劑，可促進DTC 細胞內胱氨酸/半胱氨酸的耗竭，具有良好的抗癌作用［29］。索拉菲尼是一種靶向酪氨酸激酶抑制劑的新型抗腫瘤藥物，研究顯示，索拉菲尼可提高TC 細胞ROS 和ACSL4 蛋白表達水平，抑制SLC7A11 和GPX4 表達，進而誘導TC 細胞發生鐵死亡［30］；另一項研究亦發現，TC 細胞線粒體內嵴萎縮的特征性形態學變化［25］。安羅替尼不僅通過劑量依賴性方式增強ATC 細胞的鐵死亡，當聯合自噬抑制劑CQ 的抗癌效果更顯著，且腫瘤標志物Ki-67 的表達更低，表明聯合療法效果更優［31］。上述治療方式雖處于基礎研究階段，但可為臨床轉化治療提供新思路。

5 鐵死亡在甲狀腺癌預后評估中的作用

截至目前，基于三個數據庫（TCGA、GEO、FerrDb）研究關于TC 患者鐵死亡相關基因的表達譜顯示，鐵死亡調節基因可有效預測患者的預后和總生存期。低風險組基因DPP4、GPX4、TYRO3、TIMP1、GSS、ISCU 等表達與更好的預后和總生存期相關，相比之下，高風險組基因TFRC、PGD、HMGCR、SQLE、TF、MIOX 等表達與預后不良有關［23-26，32］。因此，這些基因的表達可作為預測TC 患者預后的生物標志物。

綜上所述，鐵死亡調節靶點是SLC7A11 和GPX4，其他調節因子Nfr2和HO-1亦具有重要作用；其中下調GPX4 是抑制甲狀腺癌PI3K-AKT-mTOR信號通路的重要分子，且NCOA4介導的鐵蛋白自噬是新發現的抗癌信號通路［33］。這些分子在調節TC鐵死亡信號通路中發揮重要作用，且可被不同的治療方法所針對。此外，最近的生物信息學分析顯示，鐵死亡調節基因具有預測TC 總生存期的良好效能且患者的預后與免疫反應密切相關，但目前關于TC鐵死亡與免疫系統的研究尚存在爭議，建議今后的研究應繼續探討TC 中鐵死亡機制與免疫應答的關系。