老年乳腺癌患者癌組織中YTHDF1、E2F8 蛋白表達變化及與預后的關系

馮鐸，徐菲，吳曉琴，鄒天輝，劉堯，王寰昱

華中科技大學協和深圳醫院甲乳外科，廣東深圳518052

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，全球每年新發病例達230萬例［1］。由于治療的耐受性差、合并其他基礎疾病及機體功能退化等因素，老年乳腺癌患者預后較差［2］。改良根治術是治療乳腺癌最常用的術式，但術后有10%～30%的患者發生局部復發或遠處轉移［3］。深入研究影響老年乳腺癌患者的預后因素對早期干預具有重要意義。N6-甲基腺苷RNA結合蛋白1（YTHDF1）具有RNA結合活性和N6甲基腺苷（m6A）修飾活性，參與信使RNA 的穩定性及翻譯起始的調節［4］。近年研究發現，YTHDF1 能增強腫瘤細胞無氧糖酵解，促進卵巢癌［5］、宮頸癌［6］等惡性腫瘤的增殖及轉移，是潛在的腫瘤預后相關標志物。E2F 轉錄因子8（E2F8）屬于轉錄因子家族成員，參與調節細胞周期、胚胎發育及血管生成等多種生物學過程［7］。研究表明，在黑色素瘤、肝癌等惡性腫瘤中E2F8表達上調，其能促進腫瘤細胞由G1到S期的轉換，導致腫瘤過度增殖及患者不良預后［8］。目前老年乳腺癌中YTHDF1、E2F8 的表達與預后的關系尚不清楚。本研究觀察老年乳腺癌患者癌組織中YTHDF1、E2F8 蛋白表達變化，探討二者與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年1 月—2018 年2 月就診于本院的146 例老年乳腺癌患者，年齡60～81（68.59 ± 5.25）歲；病理類型：浸潤性癌99 例，非浸潤性癌47例；腫瘤最大徑：≤2 cm 94例，＞2 cm 52例；合并淋巴結轉移37 例；TNM 分期：Ⅰ期88 例，Ⅱ期58 例；組織學分級：Ⅰ級40 例，Ⅱ級52 例，Ⅲ級54例；雌激素受體（ER）陽性67 例；孕激素受體（PR）陽性65例；人表皮生長因子受體2（HER-2）陽性35例。納入標準：老年女性，年齡＞60 歲；均接受乳腺癌改良根治術治療，術后病理檢查明確診斷為乳腺癌；單側乳腺癌；首次診治，既往無手術及放化療治療；病歷及隨訪資料完整。排除標準：繼發性乳腺癌；多中心病灶或雙側乳腺癌；合并遠處轉移；合并其他惡性腫瘤；合并嚴重肝腎等臟器衰竭；合并精神障礙性疾病、不能或不愿接受術后規范化治療及不能配合隨訪的患者。本研究經醫院倫理委員會審核通過。

1.2 YTHDF1、E2F8蛋白表達檢測 采用免疫組化染色法。術中取癌組織和癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞2 cm，經病理檢查明確為正常乳腺組織），以石蠟包埋，5 μm 厚切片，脫蠟和水化，檸檬酸緩沖液中抗原修復，100 ℃ 3 min，山羊血清封閉后一抗（兔抗人YTHDF1、E2F8 多克隆抗體，購自美國Invitrogen 公司）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h 后顯色液顯色，蘇木精染色后脫水透明化，中性樹膠封片。免疫組化染色相關試劑均購自北京博奧森生物科技有限公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。由兩位病理醫生進行免疫組化染色評定。染色面積評分：腫瘤染色面積≤10%計0 分，11%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分。染色強度評分：未染色計0分，淡黃色染色計1分，棕黃色染色計2 分，深棕褐色染色計3 分。以上兩項評分乘積≥4為陽性。

1.3 術后治療 術后參考2009 年美國國立綜合癌癥網絡指南［9］，中低危乳腺癌患者予多西他賽、環磷酰胺聯合化療方案，化療4周期，化療期間聯合曲妥珠單抗治療；高危患者加鉑類藥物?；颊呔邮?0 Gy 劑量的全乳及患側胸壁放療，瘤床增加10 Gy 放射劑量，總療程3～4 周，分次劑量2 Gy。ER、PR 陽性乳腺癌患者，術后予以芳香化酶抑制劑依西美坦或來曲唑治療。

1.4 隨訪及預后評價 患者出院后，以門診復診和電話回訪的方式對其進行隨訪，每3～6 個月隨訪1次，共隨訪5 年。隨訪至2023 年2 月1 日，記錄患者隨訪期間腫瘤復發、轉移以及死亡的時間。無進展生存期定義為患者自出院至腫瘤復發、轉移或死亡的時間。

1.5 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；用Spearman秩相關分析乳腺癌組織YTHDF1 與E2F8 表達的相關性；用Kaplan-Meier 法分析YTHDF1、E2F8 蛋白表達與患者無進展生存預后的關系；Cox 回歸分析老年乳腺癌患者無進展生存預后的影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織YTHDF1、E2F8 蛋白表達比較 乳腺癌組織YTHDF1、E2F8 棕黃色陽性染色主要定位于細胞核。乳腺癌組織中YTHDF1、E2F8 蛋白陽性表達率分別為79.45%（116/146）、74.66%（109/146），癌旁組織中YTHDF1、E2F8蛋白陽性表達率分別為11.64%（17/146）、8.22%（12/146）。乳腺癌組織中YTHDF1、E2F8 蛋白陽性表達率高于癌旁組織（P均＜0.05）。

2.2 乳腺癌組織中YTHDF1與E2F8蛋白表達的相關性 Spearman 秩相關分析結果顯示，乳腺癌組織中YTHDF1與E2F8蛋白表達呈正相關（r=0.706，P＜0.05）。

2.3 YTHDF1、E2F8蛋白表達與老年乳腺癌患者臨床病理特征的關系 TNM 分期Ⅱ期、腫瘤最大徑＞2 cm、合并淋巴結轉移老年乳腺癌患者癌組織中YTHDF1、E2F8蛋白陽性表達率高于TNM分期Ⅰ期、腫瘤最大徑≤2 cm、無淋巴結轉移的癌組織（P均＜0.05）。見表1。

表1 YTHDF1、E2F8蛋白表達與老年乳腺癌患者臨床病理特征的關系［例（%）］

2.4 YTHDF1、E2F8蛋白表達與老年乳腺癌患者無進展生存預后的關系 隨訪6～60（52.74 ± 7.18）個月，32例患者發生腫瘤進展。YTHDF1蛋白陽性、陰性患者5 年無進展生存率分別為73.68%（84/114）、93.75%（30/32）；E2F8蛋白表達陽性、陰性患者5年無進展生存率分別為71.70%（76/106）、95.00%（38/40）。YTHDF1、E2F8 蛋白表達陽性患者5 年無進展生存率低于其蛋白表達陰性患者（P均＜0.05）。

2.5 老年乳腺癌患者無進展生存預后的影響因素 以老年乳腺癌患者隨訪中是否發生進展為因變量（1=進展，0=無進展，t=時間），以各臨床病理特征及YTHDF1、E2F8 蛋白表達為自變量，單因素及多因素Cox回歸分析結果顯示，TNM 分期Ⅱ期、合并淋巴結轉移、YTHDF1 蛋白陽性表達、E2F8 蛋白陽性表達是老年乳腺癌患者無進展生存預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表2、3。

表2 影響老年乳腺癌患者無進展生存預后的單因素Cox回歸分析

表3 影響老年乳腺癌患者無進展生存預后的多因素Cox回歸分析

3 討論

近年來隨著人口老齡化及人口預期壽命的延長，老年乳腺癌的發病也呈逐漸升高的趨勢。據美國監測流行病學數據庫統計，65 歲以上的乳腺癌患者占所有乳腺癌患者的40%［10］。目前早期老年乳腺癌主要采取改良根治術為主的綜合治療，但由于老年患者病史復雜、治療耐受性等因素，部分患者術后會發生腫瘤復發、轉移，導致治療效果不佳。因此，深入研究乳腺癌發病機制，尋找能夠評估老年乳腺癌預后的標志物，具有重要意義。

m6A修飾是真核細胞mRNA最常見的化學修飾方式。YTHDF1 是YTH 同源結構域蛋白家族成員，通過其羧基末端YTH 結構域與癌基因或抑癌基因的mRNA 結合，以m6A 修飾的方式調節基因mRNA的翻譯，參與惡性腫瘤的發生、發展［5］。本研究中，乳腺癌組織中YTHDF1 蛋白表達上調，與既往研究［11］結果一致。乳腺癌中YTHDF1表達上調與基因擴增有關。研究發現，乳腺癌中YTHDF1 基因拷貝數存在擴增型突變，導致YTHDF1 在轉錄水平顯著增加，YTHDF1抑制腫瘤微環境免疫細胞浸潤，促進腫瘤免疫逃逸，導致腫瘤進展［12］。尚有研究發現，乳腺癌細胞中YTHDF1能夠識別結合轉錄因子叉頭框M1 的mRNA，促進其m6A 修飾及蛋白翻譯，促進細胞周期由G0期向G1期轉換和上皮-間充質轉化的發生，導致腫瘤細胞過度增殖、遷移［11］。這與本研究觀察到腫瘤最大徑＞2 cm、合并淋巴結轉移及TNM 分期Ⅱ期乳腺癌組織中YTHDF1蛋白陽性表達率高一致。本研究中，YTHDF1 蛋白陽性表達的老年乳腺癌患者無進展生存預后較差，提示YTHDF1 是潛在的評估老年乳腺癌患者預后的腫瘤標志物。YTHDF1 蛋白陽性表達的患者腫瘤惡性程度高，腫瘤遠處轉移能力強，術中殘留肉眼難以分辨的轉移灶，增加患者術后復發和轉移的風險［13］。且有研究結果顯示，YTHDF1 能夠促進腫瘤細胞的DNA 復制和DNA 損傷修復，降低乳腺癌腫瘤細胞對阿霉素、順鉑及PARP抑制劑Olaparib治療的敏感性，導致患者不良預后［14］。

E2F8 編碼基因位于人類11 號染色體，屬于轉錄因子家族成員，其能夠調節細胞周期G1期到S 期的進展，維持正常細胞增殖。近年來發現，甲狀腺癌［15］、多發性骨髓瘤［16］等惡性腫瘤中，E2F8 的過度表達能夠促進啟動子區含有E2F元件的癌基因如周期素D1、有絲分裂相關激酶2 等的表達，促進腫瘤無限增殖。本研究中，乳腺癌組織中E2F8蛋白表達上調，與腫瘤TNM 分期、最大徑、淋巴結轉移有關，提示E2F8促進老年乳腺癌的發生、發展。乳腺癌中E2F8表達升高與轉錄后調控異常有關。研究表明，乳腺癌腫瘤細胞中RNA 結合蛋白NONO 能夠與E2F8 mRNA 前體結合，促進E2F8 mRNA 前體的剪接，增強E2F8的表達［17］。此外，腫瘤中E2F8表達上調能夠激活核因子κB 信號通路，促進腫瘤細胞上皮-間充質轉化，增強腫瘤細胞遷移和侵襲能力，導致腫瘤進展［18］。本研究中E2F8 蛋白陽性是影響老年乳腺癌患者無進展生存預后的獨立危險因素，表明檢測癌組織中E2F8的表達有助于評估患者預后。分析其原因，E2F8的表達升高能夠激活腫瘤細胞中微管相關絲氨酸/蘇氨酸激酶，促進ER+乳腺癌細胞的有絲分裂進程，抑制順鉑誘導的乳腺癌腫瘤細胞凋亡［19］。此外，有研究發現，膠質瘤中E2F8 的表達升高能夠直接結合檢查點激酶1 啟動子區，激活檢查點激酶1 的轉錄，增強腫瘤細胞具對放射治療的抗性，導致患者不良預后［20］。本研究中，老年乳腺癌患者癌組織中YTHDF1與E2F8蛋白表達呈正相關，表明兩者共同參與乳腺癌的發生、發展。研究表明，E2F8 是YTHDF1 的靶分子，YTHDF1 以甲基轉移酶14 依賴的方式m6A 修飾E2F8 mRNA，增強E2F8 mRNA 穩定性，促進腫瘤細胞DNA 損傷修復，導致化療耐藥性的形成［14］。

綜上所述，老年乳腺癌組織中YTHDF1、E2F8蛋白高表達，兩者與腫瘤TNM 分期、腫瘤最大徑及淋巴結轉移有關，在乳腺癌腫瘤發生、發展中可能發揮協同作用。YTHDF1、E2F8 蛋白陽性是影響老年乳腺癌患者無進展生存預后的獨立危險因素。本研究未能對YTHDF1、E2F8 在乳腺癌中的作用機制進行研究，有待進行深入的基礎和臨床試驗，進一步探討兩者的臨床應用價值。