白樺脂酸在Va24NKT 細胞殺傷胰腺癌細胞中的作用機制研究

王經翠 李鳳英 徐衛(wèi)東 王新立

惡性腫瘤對人類的生命健康造成嚴重威脅，當前藥物研發(fā)的熱門方向是各個國家重點關注的方面，白樺脂酸因其在抑制腫瘤發(fā)生和轉移中的作用而備受關注，與這些生物活性分子相關的免疫學研究也取得了顯著進展，為不同癌癥的創(chuàng)新治療干預提供了機會[1，2]。不同類型的免疫細胞參與腫瘤細胞的識別殺傷等作用，近年來免疫治療成為胰腺癌的治療熱點。自然殺傷T 細胞（Nature killer T cell，NKT）是T 淋巴細胞中一種獨特的淋巴細胞亞群，細胞表面存在NK 細胞受體和T 細胞受體，人體淋巴細胞存在多種不同類型，而NKT 細胞屬于較為重要的一種，其被成功激活后會分泌NKG2D 等物質對腫瘤細胞進行攻擊，研究發(fā)現NKT 對腫瘤有重要的免疫監(jiān)視作用，同時介導天然免疫和獲得性免疫[3，4]。本研究采用多種技術手段分析NKT 細胞對胰腺癌SW-1990 細胞的殺傷作用，以探索胰腺癌免疫治療新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料白樺酯酸（Betulinic acid）來自Sigma 公司（BetA，純度＞99%），人胰腺癌細胞株SW-1990（上海細胞生物研究所）淋巴細胞分離液購自天津市TBD 生物制品有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自北京新光生物試劑有限公司；人AB 血清來自徐州市臨床血液中心；胎牛血清（Gibco）；PE 標記的CD56、CD8、CD161、TCRVa24 單克隆抗體為杭州聯科生物公司產品；乳酸脫氫酶試劑盒Gibco-Bai；DMEM 細胞培養(yǎng)液購自北京新光生物試劑有限公司、胰蛋白酶消化液來自Sigma 公司、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京新光試劑有限公司；PE 標記的NKG2D 購自杭州聯科生物公司。

1.2 儀器流式細胞檢測儀購自美國BD 公司，日本Olympus 倒置熒光顯微鏡，全自動酶免分析儀購自北京西亞克技術有限公司。12 孔培養(yǎng)板，96 孔培養(yǎng)板購自杭州聯科生物；垂直板電泳裝置（美國Beckman 公司），低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；電轉移槽（美國Thermo 公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國Heraeus 公司）；超凈工作臺Yf-876SB 型（蘇州凈化設備廠）；細胞培養(yǎng)瓶Bio-Rad（Hercules，CA.美國）。

1.3 方法

1.3.1 人外周末梢血Va24NKT 細胞培養(yǎng) 取健康獻血者外周血100mL，加入肝素抗凝，加入淋巴細胞分離液，吸取純化的NKT 細胞，加入PE 標記的CD56、CD8、CD161、TCRVa24 單克隆抗體，在倒置顯微鏡下觀察NKT 細胞的數量和形態(tài)，進行細胞表面標志雙熒光檢測和其他實驗，Va24NKT 細胞比例＞90%，符合實驗要求[5，6]。

1.3.2 胰腺癌細胞株SW-1990 培養(yǎng) 復蘇后的SW-1990 細胞無菌條件下，置于10%的小牛血清，然后放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)，細胞鋪滿瓶底時，于倒置顯微鏡下觀察SW-1990 細胞的數量、形態(tài)，收集對數生長期細胞用于實驗。

1.3.3 MTT 法檢測白樺脂酸對人Va24NKT 細胞生長的影響 收集培養(yǎng)Va24NKT 細胞后分成兩組。實驗組Va24NKT細胞中加入不同濃度的白樺脂酸（8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL），對照組Va24NKT 細胞中加入不含白樺脂酸的等量培養(yǎng)液。在酶標儀上測定檢測標本吸光度（A）值，評估Va24NKT 細胞存活率，計算Va24NKT 平均值。細胞生長增殖率（%）=（實驗組A 值-空白對照組A 值）/空白對照組A 值×100%。

1.3.4 MTT 法檢測白樺脂酸對胰腺癌細胞株SW-1990 生長的影響 收集培養(yǎng)胰腺癌細胞株，分成兩組，白樺脂酸+SW-1990 組：加入不同濃度的白樺脂酸共培養(yǎng)24h，白樺脂酸濃度設為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL；對照組SW-1990 細胞加入等量的培養(yǎng)液，不含白樺脂酸[5，6]。在酶標儀上測定各孔吸光度（A）值，評估SW-1990 細胞存活率，計算SW-1990 細胞平均值。細胞生長抑制率IR（%）=（空白對照組A 值-實驗組A 值）/空白對照組A 值×100%。

1.3.5 LDH 法檢測白樺脂酸在Va24NKT 細胞對胰腺癌細胞株SW-1990 殺傷作用中的影響 設兩組，對照組：未經白樺脂酸作用的Va24NKT 細胞和SW-1990 細胞，檢測Va24NKT 細胞對SW-1990 的殺傷活性；Va24NKT 細胞組：白樺脂酸作用Va24NKT 細胞24h 后，檢測Va24NKT 細胞對SW-1990 細胞的殺傷活性。Va24NKT 細胞殺傷活性（%）=（實驗組A 值-效應細胞自然釋放組A 值）/（靶細胞最大釋放A 值-靶細胞自然釋放A 值）×100%。

1.3.6 流式細胞術檢測白樺脂酸對人Va24NKT 細胞表面NKG2D 受體表達的影響 設兩組，對照組：Va24NKT 細胞加入等量的培養(yǎng)液，不含白樺脂酸；根據MTT 及LDH 對濃度結果進行篩選，白樺脂酸+Va24NKT 細胞組：白樺脂酸作用Va24NKT 細胞24h；白樺脂酸選3 個不同濃度：1、0.5、0.25μg/mL 進行實驗。

1.3.7 MTT 法檢測MEK 阻斷劑PD98061 在白樺脂酸對人Va24NKT 細胞生長的影響 設三組，對照組：Va24NKT 細胞中加入等量培養(yǎng)基，不含藥物；PD98061+白樺脂酸組：PD98061 作用Va24NKT 細胞1h 后，再加入白樺脂酸共培養(yǎng)24h；白樺脂酸組：白樺脂酸作用于Va24NKT 細胞24h。PD98061+白樺脂酸組和白樺脂酸組設5 個不同的濃度（2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL）孵育后測定各孔光吸收度值，計算IR。

1.3.8 Western blot 方法檢測白樺脂酸對Va24NKT細胞總ERK1/2、P-ERK1/2 蛋白表達的影響 高速離心收集Va24NKT 細胞，加入細胞裂解液，搖勻，冰浴，離心，棄沉淀，細胞刮刮下蛋白作為細胞總蛋白進行蛋白定量檢測。把等體積蛋白上樣和蛋白提取物緩沖液混合，加載蛋白于電泳樣品孔中，電泳后半干電轉移到硝酸纖維素膜上，一抗、二抗孵育進行Western blot，掃描條帶，分析灰度值[5～8]。

2 結果

2.1 Va24NKT 細胞的培養(yǎng)結果經培養(yǎng)10d 后，Va24NKT 細胞比例從擴增前的5.12% 增加到91.27%。見圖1～2。透射電鏡見Va24NKT 細胞呈圓形，表面有較多的細長突起的微絨毛，胞質中見多組高爾基氏器，較豐富的粗面內質網，線粒體細小，電子密度高，還可見高電子密度顆粒和脂滴，細胞核橢圓有凹陷，常染色質多細小，分布均勻，異染色質少，核仁明顯。見圖3。

圖1 培養(yǎng)前細胞

圖2 培養(yǎng)后局部細胞集落

圖3 培養(yǎng)后Va24NKT 細胞瑞姬氏染色和透射電鏡超微結構

2.2 MTT 法檢測不同濃度白樺脂酸對Va24NKT 細胞和SW-1990 細胞生長的影響使用不同濃度的白樺脂酸作用于Va24NKT 細胞孵育后生長情況與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），白樺脂酸濃度在0.125～2μg/mL 時能夠促進Va24NKT 細胞的增殖，在0.25μg/mL 時，增殖率達峰值（35.25%），在4μg/mL 以上時抑制Va24NKT 細胞的生長。不同濃度的白樺脂酸作用SW-1990 細胞24h 后，檢測結果顯示抑制率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），當白樺脂酸濃度在0.125～8μg/mL 時，隨著濃度的遞增，SW-1990 的抑制率逐漸增高，白樺脂酸濃度在8μg/mL 時，SW-1990 的抑制率最高（54.83%），在0.125μg/mL 時，抑制率最低（8.60%），與濃度增高呈現正比例。見表1。

表1 不同濃度白樺脂酸對人Va24NKT 細胞和胰腺癌細胞株SW-1990 生長的影響（，n=8）

表1 不同濃度白樺脂酸對人Va24NKT 細胞和胰腺癌細胞株SW-1990 生長的影響（，n=8）

注：各濃度組與對照組比較，*P＜0.05

2.3 不同濃度白樺脂酸分別作用Va24NKT 細胞24h 后，對SW-1990 細胞株的殺傷活性變化前期預實驗及MTT 測白樺脂酸作用Va24NKT 細胞在大于4μg/mL 時Va24NKT 細胞增殖率下降，故去掉4μg/mL、8μg/mL 組。不同濃度的白樺脂酸作用Va24NKT 細胞24h 后，Va24NKT 細胞對SW-1990細胞的殺傷活性與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在0.25μg/mL 時，Va24NKT 細胞的殺傷活性最強。Va24NKT 細胞對使用不同濃度的白樺脂酸誘導24h 后SW-1990 細胞的殺傷活性與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但各濃度組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同濃度白樺脂酸作用Va24NKT 細胞24h 后對SW-1990 細胞殺傷活性及對人Va24NKT 細胞NKG2D表達的影響（，n=6）

表2 不同濃度白樺脂酸作用Va24NKT 細胞24h 后對SW-1990 細胞殺傷活性及對人Va24NKT 細胞NKG2D表達的影響（，n=6）

注：各濃度組白樺脂酸作用Va24NKT 細胞24h 后對SW-1990 細胞殺傷活性與對照組比較，aP＜0.05。各濃度組白樺脂酸作用Va 24NKT 細胞24h 后、Va24NKT 細胞對NKG2D 表達與對照組比較，*P＜0.05；1μg/mL 組vs 0.5μg/mL組、1μg/mL vs 0.25μg/mL 組NKG2D 表達△P＜0.05；0.5μg/mL vs 0.25μg/mL NKG2D 表達#P＜0.05

2.4 白樺脂酸作用Va24NKT 細胞24h 后，對Va24-NKT 細胞NKG2D 表達的影響流式細胞術檢測結果顯示，不同濃度的白樺脂酸作用的Va24NKT細胞表達NKG2D 的水平與對照組比較明顯提高（P＜0.05），在0.25μg/mL 時，NKG2D 表達最高，且白樺脂酸各濃度組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2，圖4、5。

圖4 Va24NKT 細胞（對照組）NKG2D 的表達

圖5 Va24NKT 細胞經白樺脂酸（0.25μg/mL）作用后NKG2D 的表達

2.5 MEK 阻斷劑PD98061 在白樺脂酸對促進人Va24NKT 細胞生長中的影響MTT 檢測結果顯示：在PD98061+白樺脂酸組能夠明顯抑制Va24NKT細胞的生長，而白樺脂酸組能夠明顯增強Va24NKT細胞的生長，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 MEK 阻斷劑PD98061 在白樺脂酸促進人Va24NKT細胞生長中的影響（，n=6）

表3 MEK 阻斷劑PD98061 在白樺脂酸促進人Va24NKT細胞生長中的影響（，n=6）

注：不同白樺脂酸濃度的PD98061+白樺脂酸組Va24NKT 細胞生長抑制率、白樺脂酸組Va24NKT 細胞增殖率與對照組比較，*P＜0.05

2.6 白樺脂酸對人Va24NKT 細胞表達ERK1/2、P-ERK1/2 的影響檢測顯示，P-ERK1/2 表達水平在白樺脂酸組與PD98061+白樺脂酸組、對照組比較均明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但在上述各組間ERK1/2 表達無明顯變化，PD98061+白樺脂酸組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4、圖6。

表4 白樺脂酸及PD98061 對人Va24NKT 細胞表達P-ERK1/2、ERK1/2 的影響（，n=5）

表4 白樺脂酸及PD98061 對人Va24NKT 細胞表達P-ERK1/2、ERK1/2 的影響（，n=5）

注：白樺脂酸組與對照組比較，*P＜0.05；白樺脂酸組與PD98061+白樺脂酸組比較，△P＜0.05

圖6 ERK1/2 及P-ERK1/2 的表達

3 討論

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤領域素有“癌癥之王”的稱號。胰腺癌確診后的5年生存率約10%，是預后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌臨床癥狀隱匿且不典型，診斷和治療都很困難，約90%為起源于腺管上皮的導管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來明顯上升。胰腺癌早期的確診率不高，手術死亡率較高，而治愈率極低。免疫治療是通過激活人體自身免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤的一種治療手段，有很大的發(fā)展前景，其中過繼免疫治療作為研究熱點有望為胰腺癌治療帶來新的希望[1]。

人類外周血Va24NKT 細胞較少，對其研究較少的主要原因在于培養(yǎng)過程復雜。本研究通過技術手段建立較高濃度的聯合刺激，直接從外周血中擴增Va24NKT 細胞，以便對Va24NKT 細胞進行研究[5]。

白樺脂酸別名樺木酸，天然的羽扇豆烷型五環(huán)三萜化合物，白樺脂酸有幾種生物來源，可從蒲桃樹葉、白樺樹皮、酸棗仁中提取；也可以用白樺脂醇為原料通過化學合成得到。20 世紀90 年代中期經研究發(fā)現，白樺脂酸可以選擇性地殺死人類黑色素瘤細胞而不殺傷健康細胞；白樺脂酸對HIV-1 型感染有抑制作用，另外研究表明白樺脂酸對腦瘤、神經外胚層瘤、白血病等惡性腫瘤細胞也有抑制作用。其抗腫瘤作用機制主要是對腫瘤細胞的細胞毒性作用，阻斷腫瘤細胞的細胞周期，靶向誘導腫瘤細胞的凋亡和自噬，誘導腫瘤細胞分化，阻止腫瘤細胞遷移、侵襲及其他作用，提高機體免疫功能。本實驗表明，適當濃度的白樺脂酸不僅能夠促進成熟Va24NKT 細胞的增殖，而且能夠明顯提高Va24NKT 細胞對胰腺癌SW-1990 細胞的殺傷活性。0.25μg/mL 的白樺脂酸作用Va24NKT 細胞24h 后，Va24NKT 細胞的殺傷活性最強，說明白樺脂酸對Va24NKT 細胞的作用有濃度窗現象，為將來的臨床應用提供了依據。同時，適當濃度的白樺脂酸分別作用于Va24NKT 細胞和SW-1990 細胞48h 后，Va24NKT 細胞的增殖率明顯高于對照組，而SW-1990 細胞的IR 較對照組差異有統(tǒng)計學意義，說明實驗濃度范圍內的白樺脂酸能夠促進Va24NKT 細胞的生長，對胰腺癌SW-1990 細胞生長有明顯抑制作用[3，4]。

NKG2D 是Va24NKT 細胞表面的一種活化受體，在免疫監(jiān)視中起重要作用。NKG2D 可以識別并與胰腺癌細胞表面的NKG2D 配體結合，進而激活Va24NKT 細胞的殺傷效應。研究發(fā)現[9，10]，白樺脂酸可以顯著增強Va24NKT 細胞表面NKG2D的表達。白樺脂酸通過增加NKG2D 的表達，使Va24NKT 細胞能夠更有效地識別和殺傷胰腺癌細胞。進一步的研究表明，白樺脂酸還可以促進NKG2D 信號通路的激活。NKG2D 的結合激活了多個下游信號通路，包括PI3K/AKT 和MAPK/ERK 等，白樺脂酸可以增強這些信號通路的活化，進一步加強Va24NKT 細胞的殺傷能力[11，12]。這些發(fā)現有助于深入理解白樺脂酸在免疫治療中的作用機制，并為開發(fā)相關治療策略提供理論基礎。

NKG2D 主要在NK 細胞、NKT 細胞等淋巴細胞表面表達，作為一種激活性受體介導以上免疫細胞活化進而殺傷靶細胞。NKG2D 是目前為止在體內發(fā)現的唯一可以識別MICA/B 的受體，通過使效應細胞活化而引起靶細胞分解。本實驗通過流式細胞檢測經白樺脂酸作用后的Va24NKT 細胞其NKG2D 表達的變化，結果顯示，當白樺脂酸濃度在0.125～2μg/mL 作用Va24NKT 細胞24h 后，NKG2D的表達水平在Va24NKT 細胞與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，明顯呈劑量依賴關系，此結果提示，白樺脂酸增強Va24NKT 細胞對胰腺癌細胞的殺傷活性可能是通過識別腫瘤細胞表達的MICA、MICB，激發(fā)上調Va24NKT 細胞表達NKG2D 受體水平而導致腫瘤細胞的溶解及壞死[11，12]。

阻斷劑PD98061 通過MEK 作用于Va24NKT細胞1h 后再加入白樺脂酸共培養(yǎng)24h，MTT 檢測結果顯示，Va24NKT 細胞的生長抑制率在PD98061+白樺脂酸組能夠明顯抑制Va24NKT 細胞的生長，而白樺脂酸組明顯促進Va24NKT 細胞的生長，在白樺脂酸促進Va24NKT 細胞的增殖中ERK1/2 信號通路起著十分重要的作用[13]。

綜上所述，白樺脂酸不但能夠促進Va24NKT 細胞的增殖，抑制胰腺癌SW-1990 細胞的生長，而且能夠有效提高Va24NKT 細胞對胰腺癌SW-1990 細胞的殺傷活性，其機制可能與白樺脂酸上調Va24NKT細胞中NKG2D 的表達有關。以上結果為白樺脂酸應用于胰腺癌的免疫治療提供了一定依據。

（本研究項目在研究過程中，受到中國人民解放軍87 醫(yī)院生物醫(yī)學中心陳復興教授、劉軍權教授、周同海副教授的諸多幫助，在此一并致謝。）