NETosis 與糖尿病足潰瘍相關性研究進展

何於成 李開燕 周丁鵬 曾昭洋

糖尿病足潰瘍（DFU）是糖尿病最為嚴重的并發癥之一，難愈、復發率高，同時有極高的致死和致殘率。中性粒細胞（PMN）是抵御病原體入侵人體的第一道防線，其釋放的中性粒細胞外誘捕網（NETs）具有捕獲和消滅病原體的作用。NETs 的產生和釋放稱為NETosis，被認為是PMN 的一種獨特類型的細胞死亡，參與了DFU 難愈合的發病機制[1，2]。研究表明，DFU 中過多或持續存在NETosis 會延遲創面愈合[3]。本研究通過NETosis 對DFU 愈合障礙的發病機制及作為潛在治療靶點進行歸納總結，旨在為實驗研究及臨床治療提供更充足的客觀依據。

1 NETosis 的特征

NETs 的直徑為15～17nm，來源于伴有組蛋白的核組分，并與殺微生物的球狀蛋白復合，例如彈性蛋白酶、組織蛋白酶G 和髓過氧化物酶（MPO）[4，5]。NETs在細胞外空間中釋放，其染色質網捕獲微生物，限制它們的擴散并濃縮PMN 因子，從而增強殺微生物效果[6]，該過程被稱為NETosis，是PMN 的一種獨特類型的細胞死亡[7]。NETosis 主要分為以下兩種形式[8]：①煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶依賴性途徑是促炎物質激活NADPH 氧化酶而產生活性氧（ROS），其在NETs 的形成中起重要作用。由于激活NADPH 氧化酶是這個過程的關鍵步驟，因此被稱為依賴NADPH 的NETosis。②NADPH 非依賴性途徑是鈣離子載體離子霉素、A23187、pH 升高等都可以誘導，其不依賴NADPH的NETosis。影響糖尿病足創面愈合的主要是依賴NADPH 的NETosis[9]。

NETosis 的途徑之一是由NADPH 氧化酶產生ROS。ROS 促進PMN 釋放中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）和MPO，使NE 從嗜天青顆粒移位到胞漿中，并由此進入細胞核；在此NE 開始降解組蛋白，解開染色質并釋放DNA。ROS 還激活蛋白-精氨酸脫亞胺酶4（PAD4），將組蛋白上的精氨酸轉化為瓜氨酸，進一步支持染色質解濃縮和DNA 擴增，導致核膜破壞,染色質被釋放到胞質溶漿中被各種顆粒和胞質蛋白修飾[10]。NETs 最終釋放到細胞外空間中的確切機制尚未被描述，但已經提出了質膜的主動和程序化分解（與由于DNA 擴增導致的被動膜破裂相反）[11]。NADPH 合成對于維持ROS 爆發是必不可少的。在PMN 中，NADPH 由戊糖磷酸途徑的氧化分支（oxPPP）中的葡萄糖6-磷酸產生。事實上，葡萄糖6-磷酸脫氫酶（oxPPP 的第一種酶）缺陷患者表現出低水平的NADPH 和ROS，并且對細菌感染的易感性高得多[12]。

1.1 NETosis 與巨噬細胞巨噬細胞吞噬NETs，然后在溶酶體中降解。雖然這種降解本身不會誘導巨噬細胞產生促炎性細胞因子，但在脂多糖（LPS）存在下，促進巨噬細胞釋放白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）[13]。當NETs 從吞噬體移位到胞質溶膠時，DNA 可以被DNA 傳感器環GMP-AMP 合酶（cGAS）識別，其誘導體外和體內I 型干擾素的產生。cGAS/STING 途徑的刺激依賴于DNA 相關的NE，并且NE 活性的抑制可減少一半干擾素的產生[14]。也有研究表明[15]，巨噬細胞在NETs 降解后表現出表型依賴性反應，作用數小時后，M2 巨噬細胞誘導促炎反應，而M1 巨噬細胞經歷細胞死亡和核去凝。M1 巨噬細胞的核去凝聚作用以PAD4 依賴性方式發生，并導致細胞外DNA 的局部釋放。此后，M1 巨噬細胞以半胱天冬酶激活的DNA 酶降解自身的DNA，導致細胞外DNA 在24h 內清除。

1.2 NETosis 與血小板血小板是主要的外源性PMN 調節因子。病原體或細菌激活的血小板可以有效地誘導NETs 形成，進一步促進炎癥。血小板誘導NETs 的形成需要P-選擇素（其在活化時在血小板表面上調）和P-選擇素糖蛋白配體I（PSGL-1）（其在PMN 上表達）之間的相互作用[16]。血小板上P-選擇素和GPIbα/Mac-1 之間的相互作用也可調節NETosis[17]。除P-選擇素外，血小板還同時釋放可溶性因子，以聚集和維持NETs 的形成[17]。事實上，過度的血小板活化決定了白細胞的過度聚集和炎癥的誘導，并促進NETs 的釋放。在感染的初始階段，NETs 對于誘捕細菌和防止細菌在血液中傳播至關重要[18]。但NETs 也促進血小板聚集、凝血酶活化和纖維蛋白凝塊形成，進而導致彌散性血管內凝血（DIC），最終損害組織氧合并導致患者死亡[19]。

在DFU 愈合中炎癥階段極為關鍵。過量的ROS 使機體內氧化還原失衡[20]，嚴重影響創面周圍神經血供與作用機制[21]，還會使促炎性因子進一步表達[22]。同時巨噬細胞M1 也會釋放大量促炎性因子，導致過度的炎癥反應使創面停滯在炎性階段，從而遷延不愈[23]。

2 高糖狀態對NETosis 的影響

高濃度的葡萄糖促進ROS 介導的NF-κB活化，其進一步增加晚期糖基化終末產物受體（RAGE）的表達[24]。進一步證實，高血糖狀態及相關代謝損傷可使PMN 引發NETs 表達，同時減少吞噬作用。在高血糖條件下培養的PMN，它的代謝紊亂可使PMN 中超氧化物增加和促炎性病癥的激活，并且垂死的PMN 可釋放大囊泡，進而使鄰近的PMN 致力于NETosis。與吞噬作用相比，高血糖癥還可能誘導促進NETosis 的下游[25]。總之高血糖可直接或間接通過AGE-RAGE 二級機制誘導氧化應激，通過激活NADPH 氧化酶導致自噬和自發性NETosis，同時減少吞噬作用[25]。

3 NETosis 與DFU

最近，許多研究表明過量NETosis 已被證明與DFU 愈合密切相關。傷口感染也可使PMN 活化和NETs 釋放[26，27]。有研究發現[28]，當NETs 出現于皮膚傷口時，在野生型（WT）小鼠皮膚傷口中產生大量NETs，但在Padi 4-/-（小鼠的PAD4 由PADi4 基因編碼）小鼠中未觀察到。并且與WT 小鼠相比，Padi 4-/-小鼠的傷口愈合加速，并且不受糖尿病的影響。脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）可破壞NETs，加速糖尿病和血糖正常WT 小鼠的傷口愈合。因此，NETs 嚴重影響傷口愈合，特別是在糖尿病中，PMN 對NETosis 更敏感。抑制NETosis 或切割NETs 可能會改善傷口愈合，并減少糖尿病中NETs驅動的慢性炎癥。使用蛋白組學，NETs 被發現在非愈合人類DFU 中升高。此外，由于DFU 與全身炎癥相關，因此在DFU 患者的血流中評估NETosis生物標志物與不具有DFU 的匹配糖尿病患者相比。NETs 成分包括彈性蛋白酶、組蛋白、PMN 明膠酶相關的脂質運載蛋白和蛋白酶3，被發現在DFU患者的血液中升高[3]。同時，與正常血糖對照小鼠（LepRm+/db）相比，缺乏瘦素受體（LepRdb/db）的糖尿病小鼠中傷口愈合顯著延遲，伴隨著高NETs 水平。此外，dsDNA、PAD4 和瓜氨酸化組蛋白H3 在體外佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）誘導的NETosis 模型中均顯著升高[29]。

近年NETosis 與DFU 之間的聯系已成為眾多學者研究熱點。Yang 等[30]在糖尿病大鼠中發現NOD 樣受體蛋 白3（NLRP3）、半胱天冬 酶1（Caspase-1）和消皮素D（GSDMD）的基因敲除阻止NETs 釋放并阻礙傷口愈合。Lee 等[31]用PMA 刺激PMN 以誘導NETosis，然后與DNaseI 孵育。他們將PMN 與巨噬細胞共培養，發現NETs 確實激活了NLRP3 炎性小體并增加了IL-1β，而在用DNaseI 處理的樣本中沒有發現這一點。最后，當給糖尿病大鼠注射DNaseI 時，發現NETs 降解改善了傷口愈合。Lee 等[32]發現促性腺激素釋放激素激動劑促進NETosis 和增加NETosis 誘導延遲傷口愈合。Stavrou 等[33]報道，凝血因子Ⅻ（F Ⅻ）在活化后由PMN 分泌，其上調αMb2 整聯蛋白并增加αMb2 的表達。細胞內鈣離子濃度升高，導致組蛋白瓜氨酸化和NETs 形成，延遲傷口愈合。血管生成在皮膚創傷愈合中起重要作用，Yang 等[2]最新發現從糖尿病患者外周血中分離的PMN 加劇NETosis 反應。NET 成分在糖尿病患者未愈合創面中富集。糖尿病傷口環境促使PMN 形成NETs，NETs 通過內皮細胞中的Toll 樣受體9（TLR-9）誘導p21 激活激酶（PAK2）活化。然后PAK2 磷酸化細胞內蛋白NF2/Merlin（神經纖維蛋白2 基因/編碼抑癌蛋白）來抑制Hippo/Yes 相關蛋白（Hippo-YAP）途徑。Yes 相關蛋白（YAP）與SMAD2 結合，從細胞質易位到細胞核中以促進內皮-間充質轉化（EndMT），最終阻礙血管生成并延遲糖尿病傷口愈合。

4 NETosis 作為DFU 潛在治療靶點

隨著DFU 愈合延遲與NETosis 之間相關性研究的不斷深入，NETosis 成為了治療DFU 的新型靶點，通過抑制或減少NETosis 引起的慢性炎性反應從而促進DFU 愈合。

Das 等[34]已經發現PKCβⅡ抑制劑Ruboxistaurin 可以抑制GSDMD，有效消除NETosis，逆轉內皮祖細胞功能障礙并防止NETs 過度形成。Liu等[35]研究了富含亮氨酸的α2-糖蛋白1（LRG1）在正常傷口和糖尿病傷口愈合中的作用。在機制上，LRGl 通過TGF-βⅠ型受體激酶ALK5 以Akt依賴性方式介導NETosis。研究表明，來自骨髓細胞的LRG1 是正常傷口愈合所需的，但在糖尿病中過量的LRG1 表達是致病性的，并易導致慢性傷口形成。針對LRG1 抑制過度NETosis 以加速DFU 愈合是一個有吸引力的策略。Yang 等[29]首次發現用硫化氫（H2S）處理可以抑制NETosis 和NETs 釋放，從而改善糖尿病傷口愈合，其機制與抑制ROS 誘導的MAPK、ERK1/2 和p38 活化有關。Huang 等[36]鑒定了乳脂球表皮生長因子Ⅷ（MFG-E8）介導的糖尿病傷口損傷的保護機制包括：①抑制活化的NLRP 3炎性體靶向IL-1β/IL-18 合成；②減弱由炎性細胞因子IL-1β/IL-18 誘導的NETs 從PMN 的釋放；③可能通過整合素β3 和限制性P2 X7 受體來控制NETs引發的NLRP3 炎性體活化；④傷口中血管生成的增強。MFG-E8 誘導傷口炎癥的消退，減少NETS積累，改善血管生成，并加速傷口閉合，支持外源性MFG-E8 施用對糖尿病傷口治療具有可能的治療潛力。Basyreva 等[37]使用適量的維生素D3/ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3 PUFA）的攝入抑制了健康受試者和2 型糖尿病患者的全血樣品中PMA，從而減少NETs 形成和細胞死亡。Hallberg 等[38]在研究中表明硫氰酸鹽（SCN-）和硒氰酸鹽（SeCN-）的使用可能會導致NETs 釋放和HOCl 產生的減少，以最大限度地減少宿主細胞的損傷，同時可殺死細菌。這些濃度的氮氧化物是無毒的，并且在體內容易實現。它們發揮抗炎和自由基清除作用的能力可能是有利的，特別是在慢性炎性疾病中，其在PMN 和其他免疫細胞的浸潤以及許多破壞性途徑中激活。Kaur 等[39]報道了含TDFA（一種由蘇氨酸、天冬氨酸和鳥氨酸組成的三肽，是第二代不可逆抑制劑，它修飾了PAD4 酶的活性位點殘基）的海藻酸鹽-GelMa 支架的開發，用于治療糖尿病傷口。由于TDFA 的存在，所開發的支架能夠更好地使細胞粘附、鋪展和增殖。體外PMN-支架相互作用結果表明NETosis 減少。Menegazzo 等[40]發現二甲雙胍治療降低了NETs 組分的濃度，其對PKCNADPH 氧化酶途徑的抑制作用相關。二甲雙胍抑制NETosis 是一種新的藥理學作用，其可以潛在地改善糖尿病中的免疫炎癥。同時另有學者研究發現[41]當患者接受大環內酯類克拉霉素治療時，通過上調NETs 上的LL-37 恢復抗菌能力。同時，由于真皮成纖維細胞活化和分化，觀察到傷口愈合改善。這些發現表明NETs 在傷口愈合中的直接積極生理作用，超過了它們的防御性抗菌作用。

5 小結與展望

由PMN 釋放的NETs 可以捕獲或殺死多種病原體。根據當前研究，自噬驅動的NETosis，既可以是有益的，也可以是有害的。在許多疾病中，NETs的過量產生可導致組織損傷并加速疾病惡化，自發或誘導產生過量的NETosis 揭示了NETs 的負面作用，因此它們成為了慢性炎癥的效應物。在DFU 中NETosis 的過度表達會損害傷口愈合。因此有效調節失控的NETosis 為DFU 的治療展現了新的前景和曙光，在未來可能很有希望研究出更加有效的治療方案。