反相液相色譜-二極管陣列法測定消毒產品中苯扎氯銨3種同系物的含量

陳松輝,錢 輝,李興根,汶海花,朱 磊,王愛霞

(泰州市產品質量監督檢驗院,國家精細化學品質量檢驗檢測中心,泰州 225300)

苯扎氯銨(BAC)是一種由脂肪烷基取代的二甲基芐基氯化銨混合物,主要有3種氯化銨同系物,分別為十二烷基二甲基芐基氯化銨(DDBAC)、十四烷基二甲基芐基氯化銨(TDBAC)、十六烷基二甲基芐基氯化銨(HDBAC)[1]。BAC屬陽離子表面活性劑,為非氧化性殺菌劑,具有廣譜、高效的殺菌滅藻能力,同時還具有一定的分散、滲透作用,被廣泛應用于消毒、醫藥、防腐、防蟲、紡織印染、工業水處理等領域。目前市售的復合季銨鹽類消毒產品,多采用BAC作為有效成分,但是有些產品中還會添加其他類型的復合成分。

2019年新冠病毒疫情爆發以來,BAC等消毒產品的需求不斷攀升。檢測發現許多消毒產品中BAC質量分數在0.1%左右或以下,按照《消毒技術規范(2002年版)》[2]等檢測時,需要取樣500 mL左右(相當于BAC 0.5 g),平行測定則至少需要1 000 mL的樣品,取樣量巨大。其次,《消毒技術規范(2002年版)》中沒有明確BAC的具體組成和比例,只是用了一個平均相對分子質量BAC(潔爾滅,C22H40ClN)來表示兩種或幾種混合物,同時滴定法也無法區別這幾種同系物。通過檢測發現,在不同廠家的產品中,BAC的幾種同系物比例是有差別的,都統一用平均相對分子質量表示有時會產生比較大的誤差,而液相色譜法可以分別定性定量同系物,并且取樣量少,適合實驗室修正滴定分析產生的誤差。此外,液相色譜儀也比GB/T 26369-2020《季銨鹽類消毒劑衛生要求》[3]中的毛細管電泳儀的應用更普遍。

目前,測定BAC的方法有滴定法[2,4]、紫外分光光度法[5]、離子色譜法[6]、毛細管電泳法[3,7]、氣相色譜-質譜法[8]、液相色譜法[9-16]、液相色譜-質譜法[17]、納升電噴霧-質譜法[18]等。我國已有極性色譜柱-液相色譜法檢測化妝品(GB/T 30931-2014)[12]、正向色譜柱-液相色譜法檢測化妝品(《化妝品安全技術規范(2015年版)》)[11]和牙膏產品(QB/T 5452-2019)[13]、毛細管電泳法測定消毒產品(GB/T 26369-2020)[3]中BAC的標準方法,但是針對BAC作為有效成分的消毒產品的檢測的反相液相色譜標準化方法尚未發現。消毒產品中BAC含量范圍較寬(質量分數從100%到0.1%,甚至0.1%以下的都有),且存在其他陽離子表面活性劑的干擾。目前,反相液相色譜法測定BAC的報道[9-10]已有不少。但是方法中絕大部分都是直接使用了1%(體積分數)三乙胺溶液作為掃尾劑,濃度水平相對較大,會在色譜柱中殘留,檢測過BAC的色譜柱一般不宜再檢測其他樣品,同時也會在樣品檢測過程中發現鬼峰。

本工作在上述文獻報道基礎上,通過方法優化,采用反相液相色譜-二極管陣列法測定消毒產品中BAC 3種同系物的含量,解決了掃尾劑三乙胺對色譜柱的可能損害、標準品與樣品中出現鬼峰的問題。方法前處理簡便快捷,準確度高,線性范圍寬,精密度、穩定性好,適用于測定消毒產品中BAC同系物的含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(DAD);S120H型超聲波提取儀;CP225D型電子天平;0.45 μm聚砜醚水相濾膜和0.45 μm聚丙烯有機濾膜。

單標準儲備溶液:2 g·L-1,準確稱取DDBAC、TDBAC、HDBAC對照品各0.02 g(精確至0.000 1 g),用水溶解并轉移至不同的10 mL容量瓶中,用水定容,搖勻,配制成質量濃度為2 g·L-1的單標準儲備溶液,于4 ℃密封避光保存。

混合標準溶液系列:移取上述單標準儲備溶液適量,混勻,用水逐級稀釋,配制成質量濃度為5,10,20,100,500 mg·L-1的混合標準溶液系列,現用現配。

含0.1%(體積分數,下同)三乙胺的0.5 g·L-1乙酸銨緩沖溶液(pH 5.0):稱取0.5 g乙酸銨,溶解于200 mL水中,加入1 mL三乙胺,轉移至1 000 mL容量瓶中,定容,用冰乙酸調節酸度為pH 5.0,過0.45 μm聚砜醚水相濾膜。

DDBAC、TDBAC、HDBAC對照品的純度均不小于98%;乙腈為色譜純;三乙胺、冰乙酸、乙酸銨均為分析純;試驗用水為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

Agilent XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫 40 ℃;流動相為體積比70…30的乙腈-含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸銨緩沖溶液(pH 5.0),流量 1.0 mL·min-1,等度洗脫;DAD檢測波長 262 nm;進樣量 20 μL。

1.3 試驗方法

準確稱取消毒產品1 g(精確至0.000 1 g),用水稀釋,并定容至10 mL容量瓶中,搖勻,超聲提取5 min后,靜置,過0.45 μm聚砜醚水相濾膜后,按照儀器工作條件進行測定。由于消毒產品中BAC的含量范圍較寬,從常量到微量均涉及,本方法取樣量按照微量進行操作,常量的可以減小取樣量,也可以進行稀釋處理后上機測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

在優化的儀器工作條件下,混合標準溶液的色譜圖見圖1。

2.2 提取條件的選擇

由于BAC屬于陽離子表面活性劑,易溶于水,選用水、70%(體積分數)乙腈溶液、乙腈、甲醇作為提取劑,結果發現,上述溶劑的提取效果都較好,幾乎沒有影響。對于液體消毒產品直接用水作為提取劑即可,也可超聲5 min;對于固體或者膏狀物,一般超聲提取5 min即可,再延長時間,提取效果變化不大。因此,試驗選擇以水為提取劑,超聲提取5 min。

2.3 色譜柱和檢測波長的選擇

試驗比較了Waters BEH C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Agilent XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)和普通國產江蘇綠盟科學儀器有限公司C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)的分離效果。結果發現,上述色譜柱分離效果都比較理想,證明此方法可以適合不同的C18反相色譜柱,具有普遍適用性。試驗采用Agilent XDB-C18色譜柱進行后續分析。

BAC的3種同系物在波長210,262 nm處有較大紫外吸收,如圖2所示。以210 nm為檢測波長,可降低檢出限,但許多化合物在210 nm都有紫外吸收,會增加底物干擾的不確定性。而消毒產品中BAC的質量濃度都大于10 mg·L-1,因此針對BAC的消毒產品而言,不需要更低的檢出限,以262 nm為檢測波長就能夠完全滿足檢測需求,且可以避免許多底物的干擾。

圖2 BAC的DAD光譜圖

2.4 流動相的選擇

2.4.1 掃尾劑三乙胺的體積分數

由于BAC的組成、結構與C18色譜柱填料相似,因此需要在流動相中添加掃尾劑,否則BAC幾乎不出峰。在0.5 g·L-1乙酸銨溶液中加入不同量的三乙胺,并用冰乙酸調節酸度為pH 5.0。使得三乙胺的體積分數分別為0.05%,0.08%,0.1%,0.2%,0.5%,1%,以乙腈與上述溶液的體積比為70:30的混合液作為流動相,考察了掃尾劑三乙胺的體積分數對色譜分離的影響,部分典型色譜圖見圖3。

圖3 三乙胺體積分數對色譜分離的影響

結果表明:隨著三乙胺體積分數的增大,BAC的3種同系物的半峰寬都減小;當三乙胺的體積分數為0.1%時,3種同系物的半峰寬達到平衡;繼續增大三乙胺的體積分數,對3種同系物半峰寬的影響不大,且會有三乙胺殘留在色譜柱中,導致出現鬼峰和色譜柱性能下降。因此,試驗選擇掃尾劑三乙胺的體積分數為0.1%,檢測完畢后,常規沖洗即可復原,減少了色譜柱的損耗,降低了檢測成本。

2.4.2 離子對試劑乙酸銨的質量濃度

固定流動相其他條件不變,試驗考察了在離子對試劑乙酸銨的質量濃度分別為0.1,0.3,0.5,0.8,1.5,5.0 g·L-1的流動相條件下色譜分離的效果,部分典型色譜圖見圖4。

圖4 乙酸銨質量濃度對色譜分離的影響

結果表明:隨著乙酸銨質量濃度的增大,BAC的3種同系物的半峰寬都減小;當乙酸銨的質量濃度為0.5 g·L-1時,3種同系物的半峰寬達到平衡;繼續增大乙酸銨的質量濃度,對3種同系物的半峰寬的影響不大,同樣乙酸銨還會殘留在色譜柱中,導致出現鬼峰和檢測完畢后色譜柱的沖洗時間的加長。因此,試驗選擇離子對試劑乙酸銨的質量濃度為0.5 g·L-1。

2.4.3 酸度

固定流動相其他條件不變,試驗考察了含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸銨緩沖溶液酸度(pH分別為7.0,6.0,5.0,4.5)對色譜分離的影響,部分典型色譜圖見圖5。

圖5 酸度對色譜分離的影響

結果表明:當pH減小時,BAC的3種同系物的保留時間都縮短,半峰寬也都減小;當pH為7.0,6.0時,3種同系物半峰寬都較寬,且pH為7.0時,最后一種組分的保留時間大于30 min;當pH為5.0,4.5時,3種同系物都能明顯分離,且在20 min內出峰,其半峰寬較小?？紤]到pH減小后,會對色譜柱填料不利,試驗最終選取含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸銨緩沖溶液酸度為pH 5.0。

2.4.4 流動相體積比

試驗考察了乙腈與含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸銨緩沖溶液(pH 5.0)的體積比分別為50…50,60…40,65…35,70…30,80…20,90…10時對色譜分離的影響。結果表明:當乙腈的比例增大時,BAC的3種同系物的保留時間先縮短后延長,同樣半峰寬也是先減小后增大;在體積比為70…30時,色譜分離效果最優。因此,試驗選擇乙腈與含0.1%三乙胺的0.5 g·L-1乙酸銨緩沖溶液(pH 5.0)的體積比為70…30。

2.5 柱溫的選擇

在上述選定的儀器工作條件下,試驗考察了柱溫(25,30,40 ℃)對色譜分離的影響。結果表明,隨著柱溫的升高,BAC的3種同系物的半峰寬、峰高都無明顯變化,但是出峰時間稍微前移。因此,試驗選擇的柱溫為40 ℃。

2.6 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以BAC的3種同系物的質量濃度為橫坐標,對應的色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明,BAC的3種同系物標準曲線的線性范圍均為10～500 mg·L-1,線性回歸方程和相關系數見表1。

表1 線性參數、檢出限和測定下限

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),以10倍信噪比計算測定下限(10S/N),結果見表1。

2.7 精密度和回收試驗

在BAC消毒液、復方消毒劑和消毒膏中分別進行5,20,100 mg·kg-1等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平測定8次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n=8)

由表2可知,BAC的3種同系物的回收率為98.8%～105%,測定值的RSD均小于2.0%。說明該方法對消毒產品中BAC的3種同系物均有較好的回收率及重復性,能滿足實際樣品的分析要求。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對本單位日常委托的樣品進行檢測,發現BAC的含量從常量到微量都有涉及,結果見表3。

表3 樣品分析結果

本工作提出了反相液相色譜-二極管陣列法測定消毒產品中BAC 3種同系物含量的方法。該方法取樣量少,操作簡便、快速,準確,穩定性好,通過方法優化,掃尾劑三乙胺的體積分數從1%降低到0.1%,大大縮短了分析后對色譜柱的沖洗時間,避免了掃尾劑三乙胺對色譜柱的可能損害,解決了標準品及樣品中出現鬼峰的問題,減少了色譜柱的損耗,降低了檢驗室的成本,適用于檢驗檢測機構針對消毒產品中BAC的大批量定性分析和定量檢測,適宜標準化推廣,建立相應的檢測標準方法。