魚肉中硝基呋喃類藥物殘留的測定能力驗證結(jié)果與分析

朱雨田,黎燕玲,李瑩瑩,鄭燕燕,何麗香,李錦才

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院 國家營養(yǎng)食品質(zhì)量檢驗檢測中心(廣東),深圳 518131)

硝基呋喃類藥物因具有良好的抑菌殺菌作用而廣泛用于水產(chǎn)及畜禽等動物疾病的防治[1-3]。呋喃唑酮作為最典型的一種硝基呋喃類抗生素,其在動物體內(nèi)代謝消除快,生物半衰期短,但其代謝產(chǎn)物3-氨基-2-唑烷酮(AOZ)具有很強的蛋白結(jié)合性[4],可長時間殘存在動物內(nèi)臟及肌肉等組織中,且AOZ有很強的毒副作用,長期攝入AOZ超標(biāo)的食品可能會對人體胃腸道、肝臟等器官造成一定損傷[5-8]。出于安全性考慮,世界上大部分國家均嚴禁使用該類藥物。早在2002年我國就已將硝基呋喃類藥物列為禁用藥物,并不得在動物性食品中檢出,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250號公告也再次將呋喃唑酮列入食品動物禁用化合物名錄[9]。但是,由于該類藥物藥效好、價格低廉,一些養(yǎng)殖戶依然違規(guī)使用。近幾年,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中違規(guī)使用硝基呋喃類藥物問題頻頻爆出,根據(jù)2021年1月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管司發(fā)布的《2020年食用農(nóng)產(chǎn)品市場監(jiān)管部門抽檢不合格情況》簡報顯示[10],水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物檢出情況較為突出,其中不合格AOZ就有40批次。此外,根據(jù)各級地方政府監(jiān)管抽檢通報信息顯示[11-15],畜禽水產(chǎn)品中AOZ檢出問題也頻頻發(fā)生,其中水產(chǎn)品中AOZ不合格情況尤為明顯。AOZ測定是檢驗檢測機構(gòu)開展食品中獸藥殘留分析所必備的能力之一,從事該項目檢測的機構(gòu)數(shù)量龐大,且近5年總局未組織過該類項目的國家級檢驗檢測機構(gòu)能力驗證。因此,為了了解和評價參加實驗室在水產(chǎn)品中藥物殘留方面的檢測能力和水平,識別實驗室間存在的差異,受國家市場監(jiān)督管理總局委托,本單位負責(zé)承擔(dān)2022年國家級檢驗檢測機構(gòu)能力驗證計劃《魚肉中硝基呋喃類藥物殘留的測定》(計劃編號:CNCA-22-04)的具體實施工作,該項目的實施完成將助力相關(guān)監(jiān)管部門強化對食品及食用農(nóng)產(chǎn)品承檢機構(gòu)的考核評價,也可進一步驅(qū)動和提升參加實驗室的技術(shù)能力,對規(guī)范實驗室的管理水平具有重要意義。

1 試驗方法

1.1 儀器與試劑

AB 5500+型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀;Pilot7-12E型真空冷凍干燥機;QUINTIX313-1CN型電子天平;IKA MS3型漩渦混合器;Milli-Q型純水機;3K15型離心機;Turbo Vap LV型氮吹儀。

AOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.14%;AOZ-d4同位素內(nèi)標(biāo)的純度為99.7%;甲醇、乙酸銨、2-硝基苯甲醛、乙腈為色譜純;乙酸乙酯為分析純;試驗用水符合GB/T 6682—2008一級水指標(biāo)。

1.2 樣品設(shè)計及制備

本次能力驗證共設(shè)計3個濃度水平(I、II、III組)的魚肉凍干粉,3組樣品中AOZ濃度水平均不同。每組濃度水平制備500份左右,共制備1 405份樣品,包括均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗、測試用樣品等。樣品選用草魚魚肉為基質(zhì),市場購買活魚后進行宰殺,取肌肉組織(去皮、剔除骨刺),斬拌成魚糜,根據(jù)預(yù)設(shè)各組樣品的AOZ濃度水平和魚糜質(zhì)量,分別向各組魚糜中加入3,4,7.5 mL的5 mg·L-1的AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液,充分攪拌均勻,采用真空冷凍干燥工藝進行制備,凍干后粉碎、過篩、混勻,制成凍干粉,采用7 mL西林瓶密封包裝,再放入鋁箔袋真空密封包裝,并粘貼帶有唯一性隨機編號的標(biāo)簽,制備成符合要求的能力驗證樣品,每瓶2 g左右。制備完成的魚肉凍干粉樣品按質(zhì)量比1…4加水復(fù)原后等同于新鮮的魚肉糜樣品,最小取樣量為0.4 g。3組樣品分別于不同日期進行分裝并加貼標(biāo)簽,以免混淆,于-18 ℃冷凍儲存。

1.3 樣品均勻性檢驗

采用隨機方式從3組樣品最小包裝單元各抽取10份,按照農(nóng)業(yè)部783號公告-1—2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[16](以下簡稱“農(nóng)業(yè)部783號公告-1—2006”)測定,運用單因子方差分析,F檢驗判斷各組樣品的均勻情況。待參加者回報結(jié)果后,再利用0.3σ(σ表示能力評定標(biāo)準(zhǔn)差)準(zhǔn)則再次評價樣品均勻性。

1.4 樣品穩(wěn)定性檢驗

本次能力驗證項目穩(wěn)定性檢測方法也采用農(nóng)業(yè)部783號公告-1—2006。將樣品儲存在40℃環(huán)境條件下7 d,模擬樣品的運輸穩(wěn)定性。分別在樣品制備完成后、發(fā)樣前、回收結(jié)果后進行儲存穩(wěn)定性檢驗。按照CNAS-GL003:2018 《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》要求,采用t檢驗法及0.3σ準(zhǔn)則進行評定。

1.5 樣品發(fā)放

向每家參加實驗室隨機發(fā)放兩份不同的考核樣品,記錄樣品信息,同時隨樣品一同發(fā)放相關(guān)資料,再放入冰袋進行包裝,并加貼快遞面單。

1.6 推薦檢測方法

本項目可選用GB/T 20752—2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB/T 21311—2007《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB 31656.13—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部781號公告-4—2006《動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》及農(nóng)業(yè)部783號公告-1—2006等國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 不確定度計算

本項目以穩(wěn)健平均值為指定值,根據(jù)GB/T 28043—2019《利用實驗室間比對進行能力驗證的統(tǒng)計方法》第7.7.3條要求,指定值不確定度(ux)可以按下式估計獲得。

式中:s*表示穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差;p表示結(jié)果數(shù)。

1.8 結(jié)果統(tǒng)計方法

結(jié)果回收匯總后,依據(jù)原始記錄和結(jié)果上報表,剔除小數(shù)點錯誤、單位錯誤、計算錯誤等存在粗大誤差的結(jié)果。采用穩(wěn)健統(tǒng)計技術(shù)算法A對參加者結(jié)果進行處理,穩(wěn)健平均值用作指定值,穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差用作能力評定標(biāo)準(zhǔn)差。該計劃統(tǒng)計量包括結(jié)果提交數(shù)量、穩(wěn)健平均值、穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差、不確定度、變異系數(shù)。該項目選擇z值作為各參加者的能力評定統(tǒng)計量,當(dāng)兩個樣品的AOZ項目檢測結(jié)果均符合|z|<3,則判定為滿意實驗室,當(dāng)兩個樣品的任一AOZ項目檢測結(jié)果|z|≥3,則判定為不滿意實驗室。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品均勻性和穩(wěn)定性評價

本次能力驗證所制備的3組不同濃度水平的樣品均勻性F值分別為1.89,1.66,1.43,均小于臨界值[F0.05(9,10)=3.02];穩(wěn)定性檢驗t值為0.755～1.33,均小于臨界值[t0.05(30)=2.042];均勻性平均值與各穩(wěn)定性平均值的絕對差值小于0.3σ;回收結(jié)果后,樣品間不均勻性標(biāo)準(zhǔn)差Ss分別為0.182,0.127,0.067 1,均小于0.3σ。以上結(jié)果表明樣品的均勻性和穩(wěn)定性完全滿足本次能力驗證的要求。

2.2 能力驗證結(jié)果統(tǒng)計

2.2.1 參加實驗室概況

該項目共收到339家實驗室報名,最終327家參與,12家因故未能參加。參加者地域及行業(yè)覆蓋范圍廣,全國除港澳臺外的31個省(直轄市、自治區(qū))均有實驗室報名參加,實驗室類型包括海關(guān)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、市場監(jiān)督管理、疾病控制等系統(tǒng)內(nèi)實驗室及科研院所、第三方檢測機構(gòu)等。參加者具體地域和行業(yè)分布見表1和表2。

表1 實驗室地域分布

表2 實驗室的行業(yè)分布及占比

2.2.2 能力驗證結(jié)果統(tǒng)計量

該項目統(tǒng)計量具體見表3,由表3可知,指定值不確定度均小于0.3s*,說明該項目的不確定度可忽略。根據(jù)3組參加者結(jié)果繪制頻率分布直方圖,見圖1。由圖1可知,該項目參加者結(jié)果服從近似正態(tài)分布,說明該項目可以采用穩(wěn)健統(tǒng)計技術(shù)算法A分析。

圖1 實驗室結(jié)果頻率直方圖

表3 AOZ能力驗證統(tǒng)計量

2.2.3 參加者結(jié)果評價

從總體分析結(jié)果看,滿意實驗室為297家,占總參加數(shù)量的90.8%;不滿意實驗室為30家,占總參加數(shù)量的9.2%。按不滿意實驗室類型分析,海關(guān)系統(tǒng)檢測機構(gòu)不滿意情況較為突出,占所有不滿意實驗室總數(shù)的53%。各組樣品評價結(jié)果見表4。

表4 3組樣品評價結(jié)果匯總

由表4可知:按樣品分組情況分析,本次能力驗證共收到654個測試結(jié)果;第Ⅰ組滿意的結(jié)果數(shù)209個,占該組結(jié)果總數(shù)的95.4%;第Ⅱ組滿意的結(jié)果數(shù)195個,占該組結(jié)果總數(shù)的89.9%;第Ⅲ組滿意的結(jié)果數(shù)200個,占該組結(jié)果總數(shù)的91.7%。

2.3 技術(shù)分析

2.3.1 檢測方法匯總與分析

參加本次能力驗證計劃的機構(gòu)共計采用了6種檢測方法,109家采用GB/T 21311—2007、94家采用GB 31656.13—2021、94家采用農(nóng)業(yè)部783號公告-1—2006、15家采用GB/T 20752—2006、14家采用農(nóng)業(yè)部781號公告-4—2006、1家采用《2019年國家食品污染物和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊》對測試樣品中的呋喃唑酮代謝物(AOZ)進行測定。在方法等效性方面,6種方法均為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,原理基本一致,樣品經(jīng)過鹽酸水解、鄰硝基苯甲醛衍生后,調(diào)節(jié)酸度,提取液利用乙酸乙酯液液萃取或采用固相萃取柱等方式凈化,各檢測方法的檢出限/測定下限完全滿足此次計劃要求,通過對6種方法技術(shù)參數(shù)的詳細比對[見表5,其中實驗室157#采用了序號6的檢測方法,實際稱樣量為2.00 g(折算干粉為0.40 g)滿足該能力驗證計劃最小稱樣量的要求,其采用的凈化方式為乙酸乙酯液液萃取],表明6種方法技術(shù)是等效一致的。此外,為了驗證方法之間的差異性,項目組還在方案設(shè)計之初,分別采用推薦的5種檢測方法對預(yù)試驗制備的樣品各自獨立測定10次,采用兩兩配對獨立t檢驗方式進行分析,t值均小于臨界值t0.05(18)(2.101),結(jié)果表明本項目推薦的方法之間無顯著性差異。本項目只有1家機構(gòu)使用了推薦方法以外的檢測方法,經(jīng)過對該方法及參加者提交的原始記錄等材料的審核和比較,該參加者使用的方法與推薦方法基本一致。綜上,說明本項目中參加者選擇不同的檢測方法并不會影響對結(jié)果的判斷。

2.3.2 檢測過程質(zhì)量控制

檢測結(jié)果準(zhǔn)確度的影響因素有很多方面,主要涉及人-檢測員、機-關(guān)鍵設(shè)備、料-試劑耗材、法-檢測標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)-試驗環(huán)境、測-檢測環(huán)節(jié)等。基于該項目開展情況及參加者提交資料分析,檢測機構(gòu)在測定AOZ過程中應(yīng)重點關(guān)注以下幾點。

(1) 前處理操作方面:目標(biāo)物上機前需要經(jīng)過水解衍生、提取凈化等步驟,檢測員應(yīng)嚴格按照標(biāo)準(zhǔn)及參試指導(dǎo)書要求進行。AOZ檢測的前處理過程中,按標(biāo)準(zhǔn)要求調(diào)節(jié)酸度是關(guān)鍵步驟,未控制好提取液的酸度會嚴重影響AOZ的提取效率。同時,衍生過程要控制好溫度,避光,衍生時間要滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面:AOZ的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多為固體形式,在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時應(yīng)根據(jù)證書上提供的純度進行折算。采用經(jīng)過檢定合格的天平、移液管、容量瓶等器具進行配制。配制后,儲存條件要符合標(biāo)準(zhǔn)要求。1家實驗室偏離標(biāo)準(zhǔn)要求,直接使用了AOZ的衍生物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對樣品中AOZ含量進行檢測,導(dǎo)致報送錯誤結(jié)果。

(3) 儀器參數(shù)設(shè)定方面:該項目測定均為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,色譜條件和質(zhì)譜條件都會影響到結(jié)果準(zhǔn)確度。從參加者提供譜圖記錄可以看出,個別實驗室結(jié)果峰形拖尾,積分不準(zhǔn)確,影響結(jié)果的準(zhǔn)確定量。質(zhì)譜參數(shù)的設(shè)置也會直接影響結(jié)果準(zhǔn)確度,質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集點設(shè)置不合理,且積分未做平滑處理時,峰形差,峰面積積分可能會存在誤差,也會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

(4) 檢測方法使用方面:部分實驗室偏離方法要求,且未采用相應(yīng)的質(zhì)控方式對結(jié)果進行驗證。個別實驗室選用GB 31656.13—2021、GB/T 21311—2007等檢測方法,但未按方法要求采用內(nèi)標(biāo)法進行定量,偏離方法要求,這可能是導(dǎo)致最終測試結(jié)果偏離較大的主要原因。

3 結(jié)論

作為2022年國家級檢驗檢測機構(gòu)食品領(lǐng)域能力驗證計劃之一,該項目對我國327家檢測實驗室魚肉中AOZ殘留量測定的能力進行了驗證比對分析,從統(tǒng)計分析情況看,總體滿意率達90.8%,說明我國食品檢測實驗室在水產(chǎn)品中藥物殘留檢測方面具備較高的水平。本項目實施過程中,也發(fā)現(xiàn)個別檢測實驗室在人員能力、設(shè)備維護、記錄合規(guī)性、標(biāo)準(zhǔn)理解等方面的水平有待進一步提高,建議不滿意的實驗室和結(jié)果評價偏差在臨界值附近的實驗室利用本次能力驗證分析結(jié)果,依據(jù)檢測方法標(biāo)準(zhǔn)要求,聯(lián)系機構(gòu)自身情況,仔細查找分析可能存在的問題,并按質(zhì)量管理體系要求進行整改,持續(xù)強化對實驗室人員檢測技能的監(jiān)督和評價。