非小細胞肺癌組織中CLCA4的表達情況及與病理和預后的關系

吳媛媛 劉科 齊艷麗 童小華

1商洛市中心醫院病理科，商洛 726000；2商洛市中心醫院呼吸與危重癥醫學科，商洛 726000

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的肺癌類型，占85%以上［1-3］。盡管近年來針對NSCLC的診療技術不斷進步，但該疾病的發病率和病死率仍居高不下。因此，尋找新的治療靶點和標志物對于NSCLC 的診療及預后評估至關重要。鈣激活的氯離子通道A 4（calcium-activated chloride channel regulator 4，CLCA4）是一種離子通道調節蛋白，在人體中廣泛分布，并參與多種生理過程［4］。CLCA4 可通過調節磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路（PI3K/AKT）、Janus 激酶2/信號轉導與轉錄激活子3（JAK2/STAT3）等腫瘤細胞增殖的信號途徑，介導結直腸癌的病理改變［5-6］。而PI3K/AKT、JAK2/STAT3 等腫瘤信號作為NSCLC 病理進展的關鍵信號途徑，部分學者認為CLCA4的表達與NSCLC 的病理進展及預后存在關聯［4］。然而，目前對于CLCA4 在NSCLC 中的作用和機制研究資料有限，能否成為NSCLC 新的治療靶點尚待驗證［5］?；诖耍疚闹荚谔接慍LCA4 在NSCLC 組織中的表達情況，并研究其與病理及預后的關系，為NSCLC 的診療及預后評估提供新的思路和策略。

資料與方法

1.一般資料

前瞻性選取商洛市中心醫院2019年4月至2022年4月收治的106 例NSCLC 患者進行研究。（1）納入標準：①符合肺癌的臨床診斷［7］，術前經病理穿刺活檢確診；②符合手術指征，均行NSCLC根治性切除術，術后留存病理組織送常規病理。美國麻醉師醫學會分級I～Ⅱ級；③TNM 分期Ⅱ～ⅢA 期；④卡氏健康評分＞65 分；⑤年齡＞18 歲；⑥患者家屬均簽署知情同意書。（2）排除標準：①轉移癌；②NSCLC 復發；③肝、腎功能衰竭；④合并其他呼吸道急性感染；⑤心腦血管急癥治療期；⑥妊娠期、哺乳期女性；⑦病歷資料缺失或不接受隨訪。

本研究通過商洛市中心醫院醫學倫理委員會批準（倫理編號：2019-001）。

2.研究方法

術后收集患者的臨床資料，采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測癌組織及癌旁正常組織中CLCA4的表達情況。

2.1.資料收集 人口學資料包括性別、年齡、體質量指數（BMI）、吸煙、肺癌家族史；病理資料包括組織類型、分化程度、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移。

2.2.CLCA4 陽性表達檢測 采用免疫組化法檢測病理組織中CLCA4 陽性表達情況。采用半定量評分法判定結果：染色強度分為無染色、弱染色、中等強度染色、強染色，對應評分依次記為0分、1分、2分、3分；染色數量分為陽性細胞占比＜5%、5%～25%、＞25%～75%、＞75%～100%，對應評分依次記為0分、1分、2分、3分。染色強度和染色數量得分之和≥2分判定為陽性（陽性細胞占比＜5%直接記為陰性。）

2.3.CLCA4 表達檢測方法 病理標本置于RNAlater 保護液中，-80 ℃冷凍保存，檢測前離心去除保護劑。將組織標本置于液氮中研磨成粉，依次提取總RNA、逆轉錄成cDNA，-20 ℃冷凍保存，預備PCR擴增。PCR反應體系20 μl，反應條件：95 ℃預變性10 min、變性15 s、60 ℃退火1 min、延伸溫度68 ℃，40個循環。取3個樣本復孔的均值，以CT值為基礎，采用2-△△CT法計算CLCA4 mRNA的相對表達量。

2.4.隨訪及分組 所有患者術后采用門診復查、電話隨訪等方法跟蹤隨訪12 個月，觀察無病生存期（disease-free survival，DFS）情況。

3.統計學方法

數據處理采用SPSS 24統計學軟件，計數資料以構成比或率（%）表示，采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。影響因素的分析采用多因素logistic逐步回歸模型，生存曲線Kaplan-Meier 分析與對數秩檢驗，繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評估預測效能。

結果

1.CLCA4表達（表1）

表1 106例非小細胞肺癌患者癌組織、癌旁正常組織中CLCA4表達分析

癌組織中CLCA4 陽性率及CLCA4 mRNA 的相對表達量均低于癌旁正常組織（均P＜0.05）。

2.不同病理分期患者的CLCA4表達

42 例Ⅱ期患者的CLCA4 mRNA 表達量為（0.69±0.15），64 例ⅢA 期患者的CLCA4 mRNA 表達量為（0.61±0.13），差異有統計學意義（t=2.914，P=0.004）。

3.不同預后組患者的臨床資料比較（表2）

表2 不同預后非小細胞肺癌患者的臨床資料比較

106例患者均正常隨訪12個月，其中非DFS組58例，DFS組48例。兩組患者的性別、年齡、BMI、吸煙、肺癌家族史、組織類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；非DFS組中ⅢA期患者例數高于DFS組（P＜0.05），CLCA4 mRNA表達量低于DFS組（P＜0.05）。

4.預后影響因素分析（表3）

表3 106例非小細胞肺癌患者預后的影響因素分析

以NSCLC 患者死亡為因變量（是=1，否=0），logistic 回歸分析得出，TNM 分期（OR=4.031，95%CI1.429～11.364，P=0.003）、CLCA4 mRNA 表達量（OR=0.310，95%CI0.109～0.873，P=0.003）均是NSCLC患者DFS的影響因素。

5.預測效能分析（圖1）

圖1 CLCA4 mRNA預測106例非小細胞肺癌患者DFS的ROC

ROC 分析得出，CLCA4 mRNA 預測NSCLC 患者DFS 的最佳截斷值為0.60，靈敏度為0.802（95%CI0.715～0.893）、特異度為0.809（95%CI0.721～0.904）、曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.857（95%CI0.782～0.935）。

6.生存預后分析（圖2）

圖2 不同CLCA4 mRNA 表達水平的非小細胞肺癌患者的DFS曲線比較

基于5.中CLCA4 mRNA 預測NSCLC 患者DFS 的最佳截斷值，將患者分為CLCA4 mRNA高表達組和低表達組，其中CLCA4 mRNA 高表達組50 例，死亡2 例；低表達組56 例，死亡11 例。兩組患者的生存曲線比較，差異有統計學意義（Log-rankχ2=6.006，P=0.014）。

討論

NSCLC 作為全球生存率最低的實體瘤，基因蛋白的異常表達與腫瘤細胞增殖、浸潤及轉移密切相關［8-11］。根據全球癌癥2020 年數據報道［12］，肺癌是導致癌癥相關死亡的主要原因，我國約30%的癌因死亡與肺癌有關，且發病率及病死率一直呈現升高趨勢。近幾年隨著靶向［表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑、間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因、C-ros原癌基因1酪氨酸激酶（ROS1）融合基因等］、免疫［程序性死亡受體1（PD-1）、程序性死亡受體配體1（PD-L1）、細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）抑制劑等）］等生物療法不斷取得突破，肺癌患者的生存效果顯著改善，但5 年總生存率僅保持在20%，且晚期NSCLC 患者的預后更差［13-15］。因此，針對NSCLC 新型診療靶點的探索一直是臨床醫學者研究的重點。

本研究嘗試探究CLCA4 在NSCLC 組織中的表達情況以及與病理和預后的關系，結果表明，與癌旁正常組織比較，癌組織中CLCA4 mRNA 的相對表達量更低，且隨著NSCLC 患者的病理進展，CLCA4 表達量呈降低趨勢。與Li和Huang［6］、陳慧莉等［16］報道的CLCA4 在結直腸癌、乳腺癌中的表達均被抑制一致。Horaira等［17］研究提出，在癌組織中CLCA4基因甲基化改變可導致其表達水平下降。因此，本研究分析NSCLC 組織中DNA 甲基化改變是導致CLCA4 表達降低的原因之一，CLCA4 mRNA 表達量與NSCLC 患者的DFS預后相關，且在NSCLC 患者DFS預測中效能表現良好。同時，CLCA4 mRNA 高表達組與低表達組生存曲線存在差異，進一步證實CLCA4 表達的變化與NSCLC 的病理進展及預后密切相關。JAK2/STAT3 信號通路被廣泛認為是與腫瘤細胞增殖密切相關的一條信號通路，JAK2/STAT3 信號通路的活化可誘導靶向基因的轉錄及翻譯，促進腫瘤細胞的增殖、生長和轉移［18-21］。早期研究表明，JAK2/STAT3 信號通路可通過介導干擾素-γ、白細胞介素-10 等細胞因子激活JAK2酪氨酸激酶，從而使其磷酸化并激活STAT3轉錄因子［22-23］。激活的STAT3可通過轉錄調控啟動子區域的結合，誘導靶基因（如cyclin D1、c-myc、Bcl-2等）的轉錄和翻譯，從而促進細胞周期的進程［24-26］。在肝癌、乳腺癌、肺癌等［27-28］多種惡性腫瘤中都存在JAK2/STAT3 的異常激活。Xiong 等［29］發現CircRPPH1 通過PI3K/AKT 和JAK2/STAT3 信號通路促進NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲。在NSCLC 的治療中可通過阻斷JAK2/STAT3信號通路和抑制msi2 細胞活性抑制腫瘤細胞的增殖和轉移［30］。而蔣可心等［31］研究發現，CLCA4對JAK2/STAT3信號通路具有抑制作用，且該信號途徑可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲。因此，CLCA4 與JAK2/STAT3信號通路的相互作用，同樣是影響NSCLC病理進展及預后的關鍵。后續臨床實踐可通過檢測NSCLC癌組織中CLCA4 的變化，輔助診斷或評估NSCLC 患者的病理狀態，且可能成為后續治療NSCLC的新型靶點。

綜上，NSCLC 患者癌組織中CLCA4 表達被抑制，且與病理進展及DFS 預后有關。但鑒于本研究納入樣本量有限，后續仍需完善多中心、大樣本隨機對照研究，證實本研究結論。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明吳媛媛：醞釀和設計試驗，實施研究，采集數據，分析/解釋數據，文章撰寫，統計分析，獲取研究經費，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻；劉科、齊艷麗：采集數據，對文章的知識性內容作批評性審閱，統計分析，支持性貢獻；童小華：醞釀和設計試驗，分析/解釋數據，對文章的知識性內容作批評性審閱，獲取研究經費，行政、技術或材料支持，指導