化瘀祛斑膠囊60Co-γ 射線輻照滅菌劑量的探究

★ 劉峰 王前 吳建雄 薛陽 何樞衡 （合肥億帆生物制藥有限公司 合肥 231201）

化瘀祛斑膠囊為《中國藥典》記載的中藥品種，功能主治為疏風(fēng)清熱、活血化瘀。處方由柴胡、薄荷、黃芩、紅花、當(dāng)歸、赤芍組成，用于黃褐斑、酒渣、粉刺的治療。其中柴胡、薄荷、當(dāng)歸為生粉入藥，成品制備工序較多，工藝繁瑣。生產(chǎn)過程微生物滋生問題突出，因此需對成品進(jìn)行滅菌［1］。藥品常用滅菌方式有濕熱滅菌、干熱滅菌、過濾滅菌、60Co-γ 射線輻照滅菌等［2］。由于柴胡、當(dāng)歸、薄荷中含有大量揮發(fā)性藥效成分，不適宜加熱滅菌。60Co-γ 射線輻照滅菌具有無需加熱、穿透力強(qiáng)、滅菌效果好等優(yōu)勢［3］。但輻照滅菌可能會對產(chǎn)品的穩(wěn)定性和物質(zhì)基礎(chǔ)產(chǎn)生影響［4-5］。故本研究建立化瘀祛斑膠囊特征圖譜，采用特征峰數(shù)量、相對保留時間和特征圖譜相似度對不同60Co-γ 射線輻照量劑量（0、3、6、9 kGy）滅菌的化瘀祛斑膠囊進(jìn)行對比，結(jié)合微生物限度檢查和黃芩苷含量測定綜合分析，確定化瘀祛斑膠囊60Co-γ 射線的輻照劑量。

1 儀器設(shè)備與試劑試藥

1.1 儀器設(shè)備

Agilent 1260 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204 電子分析天平（梅特勒托利多公司）；MS105DU 電子分析天平（梅特勒托利多公司）；BFT-IV 型輻照設(shè)備（北京比尼公司）。

1.2 試劑試藥

羥基紅花黃色素A（批號111637-202111，純度96.8%）、沒食子酸（批號110831-201906，純度91.5%）、芍藥苷（ 批號110736-202145，純度94.6%）、阿魏酸（ 批號110773-201915，純度99.4%）、迷迭香酸（批號111871-202007，純度98.1%）、黃芩苷（ 批號110715-202223，純度97.2%）、漢黃芩苷（批號112002-201702，純度98.5%）、黃芩素（批號111595-201607，純度98.5%）、漢黃芩素（批號111514-201706，純度100%），均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈（HPLC，TEDIA 公司）；無水甲醇（分析純，國藥集團(tuán)股份有限公司）；磷酸（HPLC，阿拉丁公司）；純化水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）。化瘀祛斑膠囊（批號210801、211201、211202、211203、220201、220202、220901、220902、230201、230202，天長億帆制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 滅菌方法

將化瘀祛斑膠囊成品包裝成箱，每箱120 盒，平放于輻照箱內(nèi)。采用BFT-IV 型輻照裝置對化瘀祛斑膠囊進(jìn)行60Co-γ 射線輻照滅菌，滅菌劑量分別為3、6、9 kGy。未滅菌和低中高輻照劑量（3、6、9 kGy）滅菌后的化瘀祛斑膠囊批號分別為：230513-01、230513-02、230513-03、230513-04。

2.2 輻照滅菌樣品微生物限度檢查

按照《中國藥典》2020 年版四部通則1105（微生物計(jì)數(shù)法）和通則1106（控制菌檢查法）檢查樣品微生物。按照通則1107（非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)），非無菌固體制劑細(xì)菌總數(shù)應(yīng)<103個、霉菌和酵母菌總數(shù)應(yīng)<102個、不得檢出大腸埃希菌（1 g）。上述4 批微生物限度檢查結(jié)果見表1。結(jié)果，未滅菌的化瘀祛斑膠囊微生物超限度，低、中、高輻照劑量滅菌后的化瘀祛斑膠囊微生物限度檢查均合格。

表1 不同輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊微生物限度檢查結(jié)果

2.3 輻照滅菌樣品黃芩苷含量測定

按照《中國藥典》2020 年版一部化瘀祛斑膠囊的黃芩含量測定項(xiàng)對不同輻照劑量滅菌后的化瘀祛斑膠囊進(jìn)行黃芩苷含量測定。結(jié)果，未滅菌的化瘀祛斑膠囊和低、中、高輻照劑量滅菌后的化瘀祛斑膠囊黃芩苷含量基本一致。見表2。

表2 不同輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊黃芩苷含量測定結(jié)果

2.4 特征圖譜研究

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Welch Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～2 min:2%（A），2～5 min:2%→15%（A），5～10 min:15%→19%（A），10～20 min:19%（A），20～25 min:19% →24%（A），25～35 min:24%（A），35～40 min:24% →27%（A），40～50 min:27%→45%（A），50～60 min:45%→60%（A），60～65 min:60% →65%（A），65～65.1 min:65%→90%（A），65.1～75 min：90%→90%（A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為240 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備 分別取羥基紅花黃色素A、沒食子酸、芍藥苷、阿魏酸、迷迭香酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，加甲醇制成每1 mL 約含50 μg 的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取化瘀祛斑膠囊樣品約0.5 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，超聲處理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 特征圖譜方法學(xué)考察

2.4.4.1 精密度試驗(yàn) 取230202 批化瘀祛斑膠囊供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行測定。以黃芩苷為參照峰，計(jì)算特征圖譜中各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果12 個特征峰的相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取230202 批化瘀祛斑膠囊供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 進(jìn)樣測定特征圖譜。以黃芩苷為參照峰，計(jì)算特征圖譜中各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果12 個特征峰的相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<2.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取230202 批化瘀祛斑膠囊6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。以黃芩苷為參照峰，計(jì)算特征圖譜中各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果12 個特征峰的相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4.4 對照特征圖譜的生成及特征峰指認(rèn) 取10 批化瘀祛斑膠囊（批號210801、211201、211202、211203、220201、220202、220901、220902、230201、230202），按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。將10 批供試品色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件進(jìn)行分析，采用Mark 峰匹配，生成化瘀祛斑膠囊對照特征圖譜。根據(jù)單位飲片制劑供試品色譜圖和對照品色譜圖，指認(rèn)了13 個特征峰。10 批供試品色譜圖和對照特征圖譜見圖1、圖2。其中8 號峰黃芩苷出峰時間適中，峰面積較大，選為S 峰。

圖1 10批供試品色譜圖

圖2 化瘀祛斑膠囊對照特征圖譜及峰指認(rèn)圖

2.4.4.5 輻照滅菌樣品與對照特征圖譜對比分析 取上述4 批化瘀祛斑膠囊，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。將4 批供試品色譜圖和對照特征圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件進(jìn)行分析，計(jì)算相似度均大于0.99。4 批化瘀祛斑膠囊特征圖譜與對照特征圖譜的疊加圖見圖3。結(jié)果不同輻照劑量化瘀祛斑膠囊特征圖譜與對照特征圖譜的相似度、特征峰數(shù)量和特征峰相對保留時間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。表明低、中、高不同劑量輻照滅菌后的化瘀祛斑膠囊與未滅菌的化瘀祛斑膠囊質(zhì)量無明顯差異。

圖3 不同輻照劑量的化瘀祛斑膠囊色譜圖與對照特征圖譜的疊加圖

2.5 輻照滅菌樣品穩(wěn)定性考察

將低、中、高輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊置40 ℃，75%RH 條件下放置3 個月后，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。將試品色譜圖和對照特征圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件進(jìn)行分析，計(jì)算相似度均大于0.99。同時檢測穩(wěn)定性樣品的黃芩苷含量和微生物限度。結(jié)果，低、中、高輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊置40 ℃，75%RH 條件下放置3 個月后，整體化學(xué)成分無明顯變化，黃芩苷含量無明顯變化，無微生物滋生。穩(wěn)定性樣品黃芩苷含量測定結(jié)果和微生物限度檢查結(jié)果見表3 和表4。

表3 穩(wěn)定性樣品黃芩苷含量測定結(jié)果表

表4 穩(wěn)定性樣品微生物限度檢查結(jié)果表

2.6 化瘀祛斑膠囊最佳滅菌劑量確定

綜合對不同輻照劑量滅菌的化瘀祛斑膠囊的特征圖譜分析、微生物限度檢查和黃芩苷含量測定，最終確定最佳輻照劑量為6 kGy。

3 討論

化瘀祛斑膠囊是由薄荷、當(dāng)歸、柴胡混合細(xì)粉與處方其他藥味的水提浸膏制得的中成藥，所含有效活性成分多樣復(fù)雜。60Co-γ 射線輻照滅菌的穿透力強(qiáng)，滅菌效果好，但是可能會對產(chǎn)品的穩(wěn)定性和物質(zhì)基礎(chǔ)產(chǎn)生影響。研究者采用《中國藥典》微生物檢查方法評價(jià)滅菌后樣品的微生物負(fù)載符合要求。化瘀祛斑膠囊藥品標(biāo)準(zhǔn)的黃芩苷含量測定方法僅可評價(jià)樣品中黃芩苷一項(xiàng)指標(biāo)，無法評價(jià)60Co-γ射線輻照滅菌對化瘀祛斑膠囊整體質(zhì)量的影響。研究者建立了化瘀祛斑膠囊特征圖譜，指認(rèn)了13 個特征峰，13 個特征峰分別歸屬于化瘀祛斑膠囊處方藥味柴胡、薄荷、黃芩、紅花、當(dāng)歸、赤芍。其中沒食子酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、迷迭香酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素均是重要的藥物活性成分，化瘀祛斑膠囊特征圖譜可以較全面地評價(jià)化瘀祛斑膠囊的質(zhì)量。通過輻照滅菌前后化瘀祛斑膠囊特征圖譜對比，確定輻照滅菌未對化瘀祛斑膠囊的質(zhì)量產(chǎn)生明顯影響。

根據(jù)原國家衛(wèi)生部發(fā)布的《60Co 輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)》（內(nèi)部試行）和國家藥品監(jiān)督管理局審評中心發(fā)布的《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》，中藥60Co-γ 射線輻照滅菌的劑量應(yīng)不高于10 kGy。因此研究者確定化瘀祛斑膠囊60Co-γ 射線輻照較佳的劑量為6 kGy。