養血祛風止痛顆粒SD 大鼠長期毒性檢測及安全性評價

★ 周建平 朱春玥 胡宇馳 邵燕 金鑫 （北京市藥物分析研究所 北京 100035）

養血祛風止痛顆粒由閆莉主任醫師基于中醫名師張錫純《醫學衷中參西錄》“升陷湯”方劑加減改良而來［1］。組方用黃芪、當歸、白術、黨參、升麻、柴胡、川芎、薄荷、荊芥、防風、羌活、白芷等藥物強化補益舉陷、通經散絡之效［2］。作為天津中醫學院第一附屬醫院獨創的代表性協定方之一，具有補氣養血、散風止痛等功效［3］，可有效緩解郁氣不暢、心神失養導致的氣血兩虛證反復發作性緊張性頭痛。然而受制于臨床安全性、中藥配方顆粒質量標準均一化等方面未進行臨床推廣應用［4］。因此本研究選擇 SD 大鼠為養血祛風止痛顆粒長期毒性藥物試驗模型，為養血祛風止痛顆粒臨床一線應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SD 大鼠80 只，體質量140～160 g，購買于北京維通利華試驗動物技術有限公司，實驗動物供給單位生產許可證號：SCXK（京）2002-0003，實驗動物使用許可證號：SYXK11-00-0049。預飼養條件：飼養環境符合國家標準GB 14922.2-2001 進行，12 h/12 h 光照交替，溫度恒定范圍為（23.5±1.5）℃，濕度恒定范圍為（50.0±10.0）%，60Co 放射性滅菌大鼠顆粒飼料（北京科澳協力飼料有限公司），預飼養5 d。

1.2 試驗藥物

養血祛風止痛顆粒（批號040513，湖南方盛制藥股份有限公司，每1 g 藥粉中含生藥4 g）。

1.3 試劑、儀器

Lisa300Dlus 全自動生化儀；MEK-6318K 全自動血球計數儀。血液生化檢測試劑盒：血球稀釋液（批號040824，上海東湖儀器試劑科技有限責任公司）；血糖（GLU，葡萄糖氧化酶法，批號240561）；丙氨酸氨基轉換酶（ALT，IFCC 推薦法，批號010521）；門冬氨酸轉移酶（AST，IFCC推薦法，批號020231）；堿性磷酸酶（ALP，IFCC推薦法，批號030191）；尿素氮（BUN，兩點動力學法，批號280201）；肌酐（Creatinine，苦味酸法，批號320251）；總膽紅素（T-Bi1，重氮法，批號300231）；總膽固醇（T-CHO，CHOD-PAP 方法，批號180351）；白蛋白（ALB，溴甲酚綠法，批號250261）；總蛋白（TP，雙縮脲法，批號260051）；肌酸激酶（CK，批號090241）；γ-谷氨酰基轉移酶（Y-GT，批號110151）；甘油三酯（TG，批號220971）。以上由北京中生生物工程高技術公司生產。

1.4 試驗方法

養血祛風止痛顆粒臨床日用量為64.0 g 生藥，合計標準日用量為1.07 g 生藥/kg（以成人60 kg計）［5］，日用最大量50 倍、25 倍、12.5 倍作為高、中、低劑量組的干預條件，分別為3.6、1.8、0.9 g生藥/mL，分別相當于54.0、27.0、13.5 g 生藥/kg。養血祛風止痛顆粒36.0 g 室溫充分研磨后去離子水溶解至10.0 mL，濃度為3.6 g 生藥/mL 溶液，二倍稀釋法分別制備1.8、0.9 g 生藥/mL 的試劑溶液。選取80 只健康SPF 級大鼠，雄雌比例為1∶1，依據性別分層進行隨機數法分層抽樣，隨機分為養血祛風止痛顆粒高、中、低劑量組和空白對照組，各20 只。養血祛風止痛顆粒高、中、低劑量組分別給予3.6、1.8、0.9 g 生藥/mL 濃度的1.5 mL/100 g BW體積灌胃，空白對照組給予1.5 mL/100 g BW 等量去離子水灌胃，各組持續灌胃給藥105 d。于給藥第105 天時各組大鼠眼靜脈叢取血2～3 mL 后離心（1 500 g/min，10 min，25 ℃），取上清液置于液氮冰箱內，-80 ℃儲存待檢，玻片法檢測凝血時間；采用MEK-6318K 全自動血球計數儀檢測紅細胞計數（RBC）、血小板計數（PLT）、白細胞計數（WBC）、分類、血紅蛋白含量（HGB）、網織紅細胞計數（Ret）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）、血小板分布寬度（PDW）、紅細胞分布寬度（RDW）、血細胞比容（HCT）、平均紅細胞體積（MVC）、平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）等指標。分別采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖（GLU）濃度；IFCC推薦法檢測丙氨酸氨基轉換酶（ALT）、門冬氨酸轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）含量；兩點動力學檢測尿素氮（BUN）濃度；苦味酸法檢測肌酐（Cre）含量；重氮法檢測總膽紅素（T-Bil）濃度；CHOD-PAP 方法檢測總膽固醇（TC）含量；溴甲酚綠法檢測白蛋白（ALB）含量；雙縮脲法檢測總蛋白（TP）、肌酸激酶（CK）、γ-谷氨酰基轉移酶（γ-GT）、甘油三酯（TG）濃度變化。當日采用“斷頸法”全部處死并進行病理系統解剖，測定心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦、子宮、卵巢、睪丸等實質性器官臟體比。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般狀況 采用鼠籠旁24 h 攝像機記錄法，每日給藥1 次，同時觀察所有試驗動物的一般狀況包括中樞神經系統、呼吸系統、胃腸系統、活動度、皮毛等狀態的改變。

1.5.2 體重變化 分別于給藥開始前及開始后，時間間隔為7 d，測定各組大鼠每7 d 體重變化。

1.5.3 血液學檢查 在給藥105 d 后，末次給藥后24 h 眼眶靜脈叢采血檢查。檢查指標包括：凝血時間（玻片法）、RBC、PLT、WBC 和分類、HGB、Ret、MPV、PCT、PDW、RDW、HCT、MVC、MCH、MCHC 等指標。

1.5.4 血液生化學檢查 在給藥105 d 后，各組隨機選取4 只雄鼠及4 只雌鼠，末次給藥后24 h 眼眶靜脈叢采血2～3 mL 后“斷頸法”處死。測定血液生化指標包括：GLU、ALT、AST、ALP、BUN、Cre、T-Bil、TC、ALB、TP、CK、γ-GT、TG。

1.5.5 器官重量測定 在給藥105 d 后，末次給藥后24 h 內“斷頸法”處死所有試驗動物，測定所有動物被摘出器官組織濕重，同時用剖檢時測定的體重計算出每100 g 體重對心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、腦、子宮和卵巢、睪丸臟器的重量比，即臟器系數。使用10%福爾馬林緩沖液固定。

1.5.6 病理組織學檢查 取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪、唾液腺、膀胱、腸系膜淋巴結、胰腺、甲狀腺、氣管、食管、胃口的器官組織，按HE 方法進行包埋、切片、染色后，光學顯微鏡觀察。

1.6 統計學方法

采用開源SPSS 20.1（社區版）統計學軟件對研究數據進行統計學層面的分析。對體重、生化指標、血液學檢查指標、臟器比等計量資料，如符合正態分布，則指標采用（±s）表示，組間采用t檢驗，單邊檢驗，以P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況比較

養血祛風止痛顆粒灌胃105 d 內，各組大鼠未見中樞神經系統、呼吸系統、胃腸系統、活動度、皮毛等狀態改變，各組大鼠的自主活動、飲水、排泄等均未見異常反應。

2.2 大鼠體重變化比較

較干預前，養血祛風止痛顆粒灌胃105 d 后各組大鼠體重均顯著上升，各組體重無顯著統計學差異（P>0.05）。見圖1、圖2。

圖1 養血祛風止痛顆粒對雌性大鼠體重變化曲線

圖2 養血祛風止痛顆粒對雄性大鼠體重變化曲線

2.3 大鼠血液學指標比較

給藥105 d 后，與空白對照組相比，各組血液學指標無顯著差異（P>0.05）。各劑量血液學指標組間差異未見劑量相關性（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血液學指標 比較（ ±s，n=8）

WBC/（×109·L-1）RBC/（×1012·L-1）PLT/（×109·L-1）HGB/（g·L-1）凝血時間/min白細胞類型LY/%MO /%GR/%空白對照組9.83±2.717.28±0.96594.30±88.50136.50±16.24.36±0.9378.57±9.1610.18±2.1811.25±7.76高劑量組9.70±3.027.14±0.55612.40±100.00137.20±7.104.95±0.7178.58±6.7610.19±2.2110.19±2.21中劑量組9.18±3.057.58±0.74571.20±68.20144.10±9.404.79±1.0272.46±13.5411.07±2.6216.47±11.34低劑量組9.70±2.337.36±0.83572.70±104.60 140.00±13.505.04±1.0679.40±4.119.94±1.6110.66±3.04組別Ret/‰HCT/%MVC/fLMCH/pgMCHC/（g·L-1）RDW/%PCT/（×1012·L-1）MPV/fLPDW/%空白對照組13.10±2.1042.50±4.5058.70±2.2018.80±0.59320.40±9.5011.90±0.500.24±0.054.13±0.2716.30±0.60高劑量組14.00±4.0042.20±3.0059.20±2.4019.30±0.96325.20±7.2012.10±0.600.26±0.054.29±0.3616.00±0.51中劑量組15.30±3.4044.60±3.2059.00±2.6019.10±0.99323.40±7.9012.00±0.600.23±0.034.09±0.2516.10±0.49低劑量組12.80±4.4042.90±4.2058.50±3.4019.10±1.34326.40±9.3011.80±0.500.24±0.044.35±0.3016.50±0.46組別

2.4 大鼠血液生化指標比較

給藥105 d 后，與空白對照組相比，各組血液生化指標無顯著差異（P>0.05）。各劑量血液生化指標組間差異未見劑量相關性（P>0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血液生化指標比較（ ±s，n=8）

表2 各組大鼠血液生化指標比較（ ±s，n=8）

組別AST/（U·L-1）ALT/（U·L-1）ALP/（U·L-1）BUN/（mmol·L-1） Crea/（μmol·L-1）γ-GT/（U·L-1）空白對照組147.70±27.6054.90±12.90123.80±66.805.99±1.0061.00±7.0019.30±10.60高劑量組140.80±30.2058.10±16.30108.10±50.506.13±1.3763.40±10.3018.20±8.00中劑量組150.30±40.7058.90±14.40125.90±49.006.41±1.0363.90±7.5021.30±9.30低劑量組144.80±33.1054.10±11.9097.00±38.807.30±1.1563.70±9.3014.00±6.40組別CK/（U·L-1）TG/（mmol·L-1）TP/（g·L-1）ALB/（g·L-1） T-CHO/（mmol·L-1） GLU/（mmol·L-1） T-Bil/（μmol·L-1）空白對照組671.00±164.900.97±0.50106.50±15.3027.50±3.001.98±0.377.98±1.153.44±1.58高劑量組608.10±182.200.77±0.40105.90±21.4025.80±6.701.75±0.458.87±1.172.84±1.07中劑量組663.10±215.300.67±0.30104.50±18.6026.20±3.801.87±0.478.70±1.222.40±0.74低劑量組671.80±191.700.87±0.30118.40±24.1028.10±5.002.11±0.598.80±1.143.52±1.85

2.5 灌胃105 d 后大鼠臟器比比較

灌胃給藥105 d 后，與空白對照組相比，各組大鼠臟器比無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 灌胃105 d后各組大鼠臟器比比較（ ±s，n=12）

表3 灌胃105 d后各組大鼠臟器比比較（ ±s，n=12）

注：子宮、卵巢、睪丸為6只。

組別心肝脾肺腎腎上腺子宮卵巢睪丸胸腺腦空白對照組 0.317±0.030 2.734±0.470 0.163±0.020 0.350±0.180 0.310±0.040 0.063±0.024 0.185±0.060 0.017±0.002 0.323±0.030 0.085±0.020 0.482±0.110高劑量組 0.338±0.050 2.767±0.370 0.183±0.040 0.334±0.090 0.326±0.020 0.069±0.022 0.200±0.040 0.019±0.004 0.331±0.020 0.097±0.040 0.485±0.080中劑量組 0.323±0.050 2.790±0.620 0.170±0.030 0.322±0.070 0.324±0.040 0.075±0.034 0.226±0.080 0.019±0.003 0.327±0.040 0.093±0.030 0.523±0.120低劑量組 0.319±0.020 2.527±0.140 0.149±0.020 0.310±0.050 0.312±0.040 0.072±0.022 0.215±0.050 0.019±0.003 0.291±0.080 0.096±0.040 0.499±0.100

2.6 病理組織學檢查

灌胃給藥105 d 后，肉眼觀察各給藥組主要臟器未見明顯病變。各組心臟、肝臟、脾臟、肺臟、氣管、食管、胃、小腸、大腸、胰腺、唾液腺、大腦、小腦、腦干、腎臟、膀胱、卵巢、子宮、睪丸、附睪、腎上腺、甲狀腺、胸腺病理組織學檢查未見明顯差異。見表4。

表4 養血祛風止痛顆粒實驗動物病理半定量分析（n=12）分

3 討論

養血祛風止痛顆粒，由黃芪、白術、黨參、升麻、柴胡、當歸、川芎、薄荷、荊芥、防風、羌活、白芷12 味中藥組成的協定方，具有補氣養血、散風止痛功效，在改善氣血兩虛證頻繁發作緊張性頭痛方面成效顯著［1］。養血祛風止痛顆粒由中醫名師張錫純《醫學衷中參西錄》“升陷湯”方劑加減改良而來［6-7］，方劑中用黃芪、當歸、白術、黨參、升麻、柴胡、川芎、薄荷、荊芥、防風、羌活、白芷等藥物，具有平肝息風、加速氣血養衛，強化疏經活絡、氣血歸樞功效［8-9］。因此其可有效疏解氣血兩虛證緊張性頭痛患者癥狀［10］。緊張型頭痛中藥方劑組分復雜［11］，長期攝取藥物累積量高等特點，藥物長期毒性檢驗及安全性檢測至關重要，是制約中藥協定方劑臨床推廣、發展的主要瓶頸。因此，養血祛風止痛顆粒長期慢性毒性試驗的研究對進一步強化臨床安全應用至關重要。本研究以養血祛風止痛顆粒50 倍、25 倍、12.5 倍臨床用量作為干預條件，經過105 d 長期灌胃后發現，養血祛風止痛顆粒均未產生明顯毒副作用，且血液學參數、血液生化指標未見明顯異常，上述結果提示養血祛風止痛顆粒良好的臨床運用安全性。為進一步探究養血祛風止痛顆粒對器官代謝性的損害，本實驗依據臟器比作為器官受損程度的比較標準，結果表明，經過高劑量長期經口灌胃后，各組均未發現臟器比異常，進一步說明養血祛風止痛顆粒的臨床應用安全性，提示了其臨床安全應用的極大潛力。

綜上所述，養血祛風止痛顆粒在動物長期毒性試驗中顯示了極高的藥物安全性，具備極大臨床應用潛力。