加味芍藥甘草湯基于Toll樣受體4/核因子κB信號(hào)通路對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠妊娠結(jié)局及免疫機(jī)制的影響※

梁爽爽 朱 莎 劉妮英 肖新益

(湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖北 武漢 430015)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)常見(jiàn)于育齡婦女,是一種內(nèi)分泌和代謝異常疾病,以無(wú)排卵、卵巢多囊樣、高雄激素血癥等為臨床主要癥狀[1]。近年P(guān)COS的發(fā)病率逐年增加,其可導(dǎo)致患者無(wú)排卵性不孕,對(duì)女性的身心健康造成嚴(yán)重影響[2]。目前,PCOS的發(fā)病機(jī)制尚未明確,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[3-4],慢性低度炎癥可介導(dǎo)PCOS的發(fā)生發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)水平在PCOS女性體內(nèi)明顯升高。因此,可從炎癥角度對(duì)PCOS進(jìn)行認(rèn)知,可為PCOS治療的靶點(diǎn)。目前臨床上常采用克羅米芬、來(lái)曲唑等藥物治療PCOS,但不能完全改善臨床癥狀,不能滿足PCOS患者的生殖需求,且不良反應(yīng)和并發(fā)癥均較多[5]。而中醫(yī)因其具有整體性、多靶點(diǎn)且副作用小的優(yōu)勢(shì),受到越來(lái)越多的關(guān)注。芍藥甘草湯主要由芍藥和甘草兩味中藥組成,兩者合用理氣健脾,滋陰養(yǎng)肝,緩急止痛,活血化瘀[6]。有研究發(fā)現(xiàn)[7-8],芍藥甘草湯及有效成分能有效降低PCOS患者血清中游離睪酮水平,進(jìn)而提高患者的妊娠率。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腎虛血瘀導(dǎo)致PCOS的發(fā)生。加味芍藥甘草湯是在芍藥甘草湯的基礎(chǔ)上加入澤蘭活血化瘀,疏通血脈,行水消腫,治療閉經(jīng)、痛經(jīng)及月經(jīng)紊亂等[9]。目前有研究發(fā)現(xiàn)[10],多種中藥可通過(guò)抑制Toll樣受體4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信號(hào)通路達(dá)到緩解或治療慢性低度炎癥目的,從而改善PCOS臨床癥狀。因此本研究建立PCOS大鼠模型,研究加味芍藥甘草湯通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)PCOS大鼠妊娠結(jié)局及免疫機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只6周齡雌性SD大鼠,SPF級(jí),均購(gòu)自青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(青)2018-0013。體質(zhì)量180～200 g,統(tǒng)一飼養(yǎng)在22 ℃、相對(duì)濕度為50%的動(dòng)物房?jī)?nèi),光暗12 h交替更換,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,自由飲水、飲食。

1.2 藥物 加味芍藥甘草湯藥物組成為白芍、甘草、澤蘭,購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中藥房,且由該醫(yī)院鑒定為正品。取白芍、甘草、澤蘭各600 g,粉碎后混合,將10倍量的水加入到藥物中,浸泡1 h后煎煮2次,每次1 h;過(guò)濾煎煮后濃縮成含生藥4.24 g/mL的藥液,即加味芍藥甘草湯。本實(shí)驗(yàn)藥量根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)中人體劑量的折算標(biāo)準(zhǔn),按低、中、高藥物比例分別為0.5∶1∶2,即得到低、中、高劑量為12.5、25.0、50.0 g/(kg·d)。炔雌醇環(huán)丙孕酮片(深圳市康哲藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字J20140114),來(lái)曲唑片(浙江海正藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20133109)。

1.3 試劑和儀器 TLR4抑制劑TAK-242(北京百奧萊博技術(shù)有限公司);TLR4、NF-κB抗體(上海連碩生物科技有限公司);吉姆薩染液(上海澤葉生物科技有限公司);高速離心機(jī)(D37520 Osterode型,德國(guó)Biofuge公司);CytoFLEX型流式細(xì)胞儀[貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司];TLR4、p-NF-κB p65、β-actin抗體(英國(guó)Abcam公司);蛋白提取試劑盒購(gòu)(北京普非生物科技有限公司);超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);DM3000生物光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司);PROTEAN小型蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.4 分組、模型制備和給藥 將80只大鼠隨機(jī)分為空白組10只和造模組70只。造模組采用來(lái)曲唑片誘導(dǎo)制備PCOS大鼠模型,將來(lái)曲唑片溶于1%羧甲基纖維素鈉中,予來(lái)曲唑溶液1 mg/(kg·d)灌胃21天;空白組大鼠予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。造模后每日對(duì)造模組大鼠進(jìn)行陰道涂片,并經(jīng)吉姆薩染液染色,觀察大鼠動(dòng)情周期變化。大鼠進(jìn)行陰道涂片處理,將棉簽浸泡在0.9%氯化鈉溶液中,然后用棉簽在大鼠陰道側(cè)壁上的1/3處輕輕刮取,將得到的黏液和細(xì)胞輕薄且均勻涂抹在載玻片上,將其置于無(wú)水乙醇中固定,3 min后將吉姆薩染液染色加入到載玻片中并染色,置于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞變化情況?？瞻捉M大鼠有4～5天的規(guī)律動(dòng)情周期,可分為4個(gè)階段,即以有核上皮細(xì)胞為主的動(dòng)情前期,以無(wú)核不規(guī)則狀角化上皮細(xì)胞為主的動(dòng)情期,同時(shí)可見(jiàn)有核上皮細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞與白細(xì)胞的動(dòng)情后期,以白細(xì)胞為主的動(dòng)情間期。而造模大鼠動(dòng)情周期明顯紊亂,表示PCOS模型制備成功。將造模成功的70只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為7組,模型組10只予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃,加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組各10只,分別予加味芍藥甘草湯12.5、25.0、50.0 g/kg灌胃,炔雌醇環(huán)丙孕酮片組10只予炔雌醇環(huán)丙孕酮片0.2035 g/kg灌胃,抑制劑組10只經(jīng)尾靜脈注射TAK-242 10 mg/kg,聯(lián)合組10只予加味芍藥甘草湯50 g/kg灌胃,同時(shí)尾靜脈注射TAK-242 10 mg/kg,空白組10只大鼠予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠均每日給藥1次,連續(xù)給藥2周。

1.5 大鼠體質(zhì)量及卵巢質(zhì)量 測(cè)量各組大鼠給藥結(jié)束后體質(zhì)量,再在末次給藥24 h后分別處死大鼠,取出卵巢,快速去除兩側(cè)卵巢多余組織,稱取卵巢組織質(zhì)量。

1.6 T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+各組大鼠末次給藥24 h后,麻醉各組大鼠,取腹主動(dòng)脈血5 mL,將血液用EDTA抗凝后,各組取60 μL血加入到流式細(xì)胞儀中,檢測(cè)T細(xì)胞亞群中CD4+、CD8+細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)卵巢組織中TLR4和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)表達(dá) 末次給藥24 h后,取各組大鼠部分卵巢組織50 mg,于冰上裂解組織至組織均漿,離心組織均漿,用DAB法檢測(cè)上清液中蛋白濃度。分別配置濃縮和分離膠,濃度分別為5%和8%,在膠孔中分別加入樣品蛋白,電泳10 min后轉(zhuǎn)膜。孵育2 h后,將5%封閉液加入到樣品中,激活后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,封閉PVDF膜1 h。分別加入一抗TLR4、NF-κB過(guò)夜,繼續(xù)加入HRP標(biāo)記的二抗,繼續(xù)孵育2 h,采用磷酸緩沖生理鹽水洗滌,取ECL發(fā)光液A和B等量混勻,加在膜的正面與之充分接觸,成像后通過(guò)TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。用ECL檢測(cè)細(xì)胞PVDF膜并成像。

1.8 檢測(cè)各組大鼠妊娠率和各組孕鼠的胚泡著床數(shù) 末次給藥后12 h,均隨機(jī)取各組8只雌性大鼠,于下午6∶00與雄鼠按照2∶1合籠,次日早8∶00檢查陰道涂片,以發(fā)現(xiàn)大量精子者記為妊娠第1天,如未見(jiàn)大量精子記為未孕鼠。于妊娠第8天下午4∶00處死,摘取雙側(cè)子宮,記錄所有孕鼠數(shù)及每只孕鼠的胚泡著床數(shù),比較各組妊娠率(妊娠率=孕鼠數(shù)/受試動(dòng)物數(shù)×100%)及各組孕鼠胚泡著床數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量比較 與空白組比較,模型組體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量均升高(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量均降低(P<0.05);加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈劑量依賴;加味芍藥甘草湯高劑量組、炔雌醇環(huán)丙孕酮片組和抑制劑組大鼠給藥后體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量?jī)蓛杀容^差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與加味芍藥甘草湯高劑量組比較,聯(lián)合組大鼠給藥后體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量均降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較 與空白組比較,模型組大鼠CD4+、CD4+/CD8+降低(P<0.05),CD8+升高(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠CD4+、CD4+/CD8+均升高(P<0.05),CD8+均降低(P<0.05);加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);加味芍藥甘草湯高劑量組、炔雌醇環(huán)丙孕酮片組、抑制劑組大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與芍藥甘草湯高劑量組比較,聯(lián)合組大鼠CD4+、CD4+/CD8+均升高(P<0.05),CD8+降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較

2.3 各組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 與空白組比較,模型組大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)均升高(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)均降低(P<0.05);加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈劑量依賴;加味芍藥甘草湯高劑量組、炔雌醇環(huán)丙孕酮片組組和抑制劑組大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與芍藥甘草湯高劑量組比較,聯(lián)合組大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平

表3 各組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠妊娠率和各組孕鼠的胚泡著床數(shù)比較 與空白組比較,模型組大鼠妊娠率和胚泡著床數(shù)均降低(P<0.05);與模型組比較,加味芍藥甘草湯中、高劑量組大鼠妊娠率升高,加味芍藥甘草湯低、中、高劑量組大鼠胚泡著床數(shù)升高(P<0.05),且呈劑量依賴;加味芍藥甘草湯高劑量組、炔雌醇環(huán)丙孕酮片組和抑制劑組大鼠妊娠率和胚泡著床數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與加味芍藥甘草湯高劑量組比較,聯(lián)合組大鼠胚泡著床數(shù)升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠妊娠率和各組孕鼠的胚泡著床數(shù)比較

3 討論

PCOS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前臨床上治療PCOS方法主要為對(duì)癥治療,但治療效果并不十分理想[11]。PCOS在中醫(yī)學(xué)中被歸為“閉經(jīng)” “不孕”“崩漏”“癥瘕”等范疇,認(rèn)為氣虛痰瘀是導(dǎo)致PCOS發(fā)病的關(guān)鍵因素。加味芍藥甘草湯中白芍養(yǎng)血斂陰,理氣健脾;甘草益血通經(jīng),緩急止痛;澤蘭活血祛瘀,利水消腫[12]。有研究表明[13],芍藥苷對(duì)離體脂肪組織分解有明顯的促進(jìn)作用,白芍對(duì)卵巢肥胖大鼠的體質(zhì)量有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,加味芍藥甘草湯可減輕PCOS大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量,且呈劑量依賴。有文獻(xiàn)顯示[14],PCOS患者輕微減重,可促進(jìn)自發(fā)排卵,增加妊娠率,且對(duì)高雄激素癥、高脂血癥有明顯的改善作用。由此可見(jiàn),加味芍藥甘草湯可通過(guò)減輕體質(zhì)量而改善PCOS癥狀。子宮內(nèi)膜是女性生殖功能的基本結(jié)構(gòu)單位,也是能量代謝活躍的器官。當(dāng)子宮內(nèi)膜容受性受損時(shí),胚泡著床會(huì)發(fā)生障礙,從而導(dǎo)致PCOS患者不易受孕或受孕后容易流產(chǎn)。本研究結(jié)果顯示,加味芍藥甘草湯可增加PCOS大鼠妊娠率和胚泡著床數(shù),提示加味芍藥甘草湯可促進(jìn)PCOS大鼠胚泡著床數(shù),進(jìn)而改善PCOS大鼠預(yù)后。有研究證實(shí),可通過(guò)上調(diào)子宮內(nèi)膜PR表達(dá)改善卵巢功能,提高子宮內(nèi)膜容受性和早期妊娠率,從而改善妊娠結(jié)局[15]。

有文獻(xiàn)顯示,機(jī)體在排卵前卵泡存在多種免疫細(xì)胞,包括T淋巴細(xì)胞等,當(dāng)免疫細(xì)胞異常表達(dá)時(shí),機(jī)體免疫功能紊亂,從而導(dǎo)致機(jī)體所分泌的免疫相關(guān)因子比例嚴(yán)重失調(diào),引發(fā)PCOS[16]。近年來(lái)免疫學(xué)快速發(fā)展,學(xué)者們也逐漸認(rèn)識(shí)到PCOS的發(fā)病機(jī)制可能與T淋巴細(xì)胞亞群密切相關(guān)[17]。在所有成熟的T淋巴細(xì)胞表面均有CD3+分子的表達(dá),而CD4+、CD8+會(huì)在不同的成熟T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)。CD4+細(xì)胞可分泌白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-12、干擾素γ(IFN-γ)等介質(zhì),進(jìn)而對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體進(jìn)行促進(jìn);而CD8+可對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體進(jìn)行抑制。胡偉嬌等[18]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),與正常女性比較,PCOS患者卵泡液中CD3+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞比例顯著降低,表明PCOS患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)處于紊亂狀態(tài)。除此之外,外周活化的T淋巴細(xì)胞可誘導(dǎo)其受體PD-1的表達(dá),并通過(guò)抑制PCOS患者CD4+和CD8+細(xì)胞功能而降低IFN-γ表達(dá),進(jìn)而對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的功能起到抑制作用;另外,當(dāng)T淋巴細(xì)胞亞群功能出現(xiàn)失調(diào)時(shí),雌激素水平降低,IFN-γ和PD-1異常表達(dá),進(jìn)而對(duì)卵泡發(fā)育、排卵造成影響。本研究結(jié)果顯示,PCOS大鼠CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高,提示PCOS大鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)處于紊亂狀態(tài),加味芍藥甘草湯干預(yù)后PCOS大鼠CD4+、CD4+/CD8+升高,CD8+降低,提示加味芍藥甘草湯可改善PCOS大鼠免疫功能。

目前,PCOS的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)慢性低度炎癥可介導(dǎo)PCOS的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),PCOS以雙側(cè)卵巢增大、白膜增厚并發(fā)生硬化、皮質(zhì)出現(xiàn)纖維化、卵巢間質(zhì)增生等為主要病理改變,同時(shí)也是慢性增生性炎癥的一種表現(xiàn)[19]。有研究顯示,激活的TLR-4 /NF-κB炎癥信號(hào)通路與多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TLR4是炎性反應(yīng)的“閘門”,適度的TLR4表達(dá)可維持機(jī)體功能,但TLR4過(guò)度表達(dá)可損傷相關(guān)組織[20]。TLR4可通過(guò)MyD88而活化NF-κB。NF-κB是炎癥啟動(dòng)和調(diào)節(jié)過(guò)程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子之一,可介導(dǎo)炎癥的發(fā)生發(fā)展。在靜息狀態(tài)下,NF -κB家族蛋白可結(jié)合其遏制物核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α),從而形成無(wú)活性三聚體,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)外源性刺激無(wú)活性三聚體后,IκB-α?xí)ㄟ^(guò)磷酸化和泛素化降解而釋放大量的NF-κB易位,從而磷酸化細(xì)胞核,后可結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控元,從而激活下游多個(gè)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致炎癥發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,PCOS大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高,加味芍藥甘草湯干預(yù)組大鼠卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)降低。由此可見(jiàn),PCOS大鼠存在慢性增生性炎癥狀態(tài),加味芍藥甘草湯可通過(guò)抑制TLR4和p-NF-κB p65的表達(dá)抑制炎癥狀態(tài)。常壯鵬等[21]研究證實(shí),加味芍藥甘草湯可能通過(guò)抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的活化減少炎癥因子釋放,達(dá)到調(diào)節(jié)卵巢激素微環(huán)境并且改善多囊卵巢形態(tài)和功能的作用。為證實(shí)加味芍藥甘草湯能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路而對(duì)PCOS進(jìn)行調(diào)控,本研究采用TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制劑TAK-242對(duì)PCOS大鼠進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示,TAK-242能降低大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量,改善大鼠體內(nèi)免疫功能,抑制卵巢組織中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá),增加妊娠率和胚泡著床率。為進(jìn)一步證實(shí)加味芍藥甘草湯是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路而對(duì)PCOS大鼠發(fā)揮作用,本研究用加味芍藥甘草湯高劑量聯(lián)合TAK-242干預(yù)PCOS大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其干預(yù)效果高于單獨(dú)使用加味芍藥甘草湯或TAK-242。

綜上所述,加味芍藥甘草湯能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路調(diào)節(jié)PCOS大鼠免疫機(jī)制,改善PCOS大鼠妊娠結(jié)局。