卵巢高級別漿液性癌驅動基因相關的臨床病理研究進展

甘文婷,張智弘,王 聰

卵巢癌是女性生殖系統病死率最高的惡性腫瘤,卵巢高級別漿液性癌(high grade serous ovarian carcinoma, HGSOC)是卵巢癌的主要類型[1]。HGSOC有多種基因變異,顯著特征是驅動突變和體細胞拷貝數變異,具有不同基因變異的HGSOC病理特征和臨床表現存在差異。最新的癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數據庫顯示96%的HGSOC患者存在TP53基因突變;乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene, BRCA)1和2胚系突變率分別為9%、8%,體系突變率約為3%;約20%具有CCNE1基因擴增。另外,PTEN、RB1、NF1和MYC等基因變異也占據一定比例[2]。目前,錯配修復(mismatch repair, MMR)缺陷/微衛星不穩定性(microsatellite instability, MSI)在婦科腫瘤中也逐漸獲得關注[3]。本文對上述基因在HGSOC中變異特點、檢測方法和相關治療的研究進展進行綜述,為HGSOC的預測、診斷和靶向藥物的研究提供理論依據。

1 TP53突變及免疫組化判讀

抑癌基因TP53基因編碼的p53蛋白屬于轉錄因子,介導多種信號轉導途徑,對細胞正常的活動進行調控。當細胞遭遇DNA損傷、缺氧、營養不足或原癌基因激活等刺激時,p53蛋白水平升高,作用于不同的靶基因,引起細胞周期阻滯、凋亡、DNA修復、衰老和鐵死亡等,抑制細胞增殖和實現抑癌作用[4]。正常輸卵管上皮分泌細胞核過表達p53蛋白,是HGSOC發生的最早期事件。TP53突變在HGSOC和前驅病變即漿液性輸卵管上皮內癌(serous tubal intraepithelial carcinoma, STIC)中的特征一致[1,5]。

在病理診斷中,TP53突變可作為HGSOC的判斷依據,TP53突變檢測的主要方法是免疫組化染色和下一代基因測序(next-generation sequencing, NGS)。Park等[6]的研究顯示免疫組化染色與NGS檢測結果的一致性達92.6%,提示p53免疫組化染色是反映TP53突變較為可靠的指標。“正常”或“野生型”呈強弱不等的核表達;“異常”或“突變型”表達則有3種模式,包括核過表達、完全缺失和胞質表達。p53核過表達模式表現為HGSOC固定良好區域細胞核彌漫強染色;完全缺失模式中腫瘤細胞均無染色,且內對照細胞(間質細胞和淋巴細胞)呈正常表達;胞質表達模式呈胞質中等或強染色,同時核不表達或正常表達;染色模式中核彌漫強表達與錯義突變相關,均不表達的染色模式常提示無義突變或移碼突變,野生型呈強弱不等的異質性表達;基于突變型的表達模式,常可通過p53免疫組化表達突變型輔助診斷HGSOC[7]。胞質表達模式與p53完全缺失或細胞核p53強表達患者相比,其預后可能較差[8]。

目前,免疫組化染色與NGS結果不一致的現象仍然存在,原因可能包括突變密碼子分析的局限性、樣本偏倚、腫瘤異質性和細胞應激延遲p53降解等[6-7]。

TP53是藥物研究的靶點,研究方向主要是恢復TP53的抑癌功能,如APR-246將突變的TP53恢復成野生型結構。目前,TP53突變靶向藥物研究依然有限[9]。

2 BRCA1/2致病機制、檢測方法與靶向藥物

有關家族性乳腺癌的遺傳學研究顯示:BRCA1和BRCA2也是卵巢癌尤其是HGSOC的風險因素,70歲卵巢癌BRCA1攜帶者的累積患病風險高達44%,而BRCA2攜帶者則為27%[10]。約25%的HGSOC有BRCA1/2的胚系或體細胞突變,BRCA1/2突變導致同源重組缺陷(homologous recombination deficiency, HRD),其作用機制是不同程度的DNA損傷有不同修復方式,其中雙鏈斷裂(double strand breaks, DSB)修復易出現問題。DSB修復主要有同源重組修復(homologous recombination repair, HRR)和非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)。當BRCA1/2突變時,斷裂的雙鏈無法通過HRR修復,此時由NHEJ進行修復。NHEJ修復中DNA連接酶直接作用于斷裂點連接核苷酸,不依賴模板易出現核苷酸的插入或缺失,導致基因組不穩定,進而發生腫瘤[11]。

BRCA1/2缺陷患者對PARP抑制劑的敏感性高,PARP抑制劑通過抑制PARP1使堿基切除修復無法行使其功能,從而阻斷細胞單鏈損傷修復[11]。在BRCA1/2缺陷的腫瘤細胞中使用PARP抑制劑,細胞的單鏈損傷修復缺陷和HRR缺陷同時存在,細胞復制過程中產生的DSB無法修復,出現合成致死效應,最終導致細胞死亡[12]。目前,國內外已有多種PARP抑制劑獲批用于卵巢癌的臨床治療。臨床試驗證實PARP抑制劑可有效延長BRCA1/2突變HGSOC患者的中位無進展生存期[13]。

采用NGS檢測明確BRCA1/2是胚系突變還是體細胞突變;檢測樣本為新鮮組織或福爾馬林固定石蠟包埋穿刺/手術標本,初步檢測突變陽性者可進一步行胚系檢測(如血液、口腔拭子等)[14]。HGSOC檢測樣本除穿刺/手術樣本外,還有腹水或胸水等細胞樣本[14]。NGS可檢測BRCA1/2基因點突變和小片段插入/缺失,部分經過特殊設計的NGS方法還可檢測大片段重排(large genomic rearrangement, LGR)。同時,NGS檢測BRCA1/2也存在缺陷,如對檢測樣本要求高,檢測LGR時易發生漏診,檢測方法和結果解讀缺乏標準化等[15]。另外,Sanger檢測是BRCA1/2點突變和小片段插入/缺失的金標準,可驗證NGS檢測結果。多重連接依賴性探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification assay, MLPA)常用于BRCA1/2基因的LGR檢測[15]。

BRCA1/2檢測的重要意義:(1)通過BRCA1/2突變篩選對鉑類藥物和PARP抑制劑敏感的HGSOC患者;(2)對未患病但攜帶BRCA1/2突變者,推薦陰道超聲和CA125檢查進行長期監測,必要時進行降低風險的預防性輸卵管-卵巢切除術(risk-reduced salpingo-oophorectomy, RRSO);(3)對BRCA1/2胚系突變者,建議其親屬也進行BRCA1/2基因檢測,明確其是否存在發病風險,對突變者隨訪觀察,必要時推薦行RRSO[16]。

3 CCNE1的致病機制、預后影響及檢測方法

CCNE1擴增和非擴增的HGSOC具有不同的病理、生物學特征和臨床結果,提示CCNE1擴增HGSOC是一個獨立亞群[17]。CCNE1編碼Cyclin E1,Cyclin E1結合并激活CDK2,促進細胞周期由G1期到S期轉換。當CCNE1擴增時,Cyclin E1水平升高,G1期到S期的轉換加快,細胞周期紊亂,出現基因組不穩定性,導致腫瘤形成[17]。

值得注意的是,Cyclin E1水平升高并不只是CCNE1擴增的結果,Cyclin E1蛋白質穩定和缺乏降解也可導致Cyclin E1升高[18]。CCNE1擴增和高表達均是HGSOC的不良預后因子,由于CCNE1擴增和HRD幾乎不同時發生,當HGSOC存在CCNE1擴增時,HRR處于活躍狀態,對化療藥物產生耐藥且對PARP抑制劑反應低[13,19-20],提示CCNE1擴增可能是部分非HRD的HGSOC藥物研究的靶點。

目前,CCNE1擴增有多種檢測方法:(1)免疫組化可檢測CCNE1蛋白表達,但不能反映CCNE1擴增[18,20]。(2)FISH可觀察CCNE1擴增情況,并計算基因拷貝數[20]。(3)顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization,CISH)融合免疫組化和FISH的特點,可檢測CCNE1擴增[20]。(4)qRT-PCR對CCNE1擴增進行定量分析[21]。

隨著藥物的不斷研發,CCNE1作為藥物治療靶點,單一或聯合應用CDK2和WEE1等抑制劑是治療的新方向[17,20],CCNE1擴增在HGSOC中的作用將會得到更多重視。

4 PTEN變異的致病機制與臨床病理特征

PTEN是常見的抑癌基因,其表達產物抑制PI3K/AKT信號通路,從而調控細胞增殖、遷移、基因組穩定和代謝。當PTEN突變或失活時,其功能出現異常,失去抑制腫瘤增殖和生長的功能[22]。

PTEN表達缺失可見于STIC中, 推測PTEN功能缺失是HGSOC的早期事件[22]。TCGA數據顯示,約7%的HGSOC存在PTEN缺失或突變[2],文獻報道20%～40%的HGSOC中PTEN表達缺失[22-24]。Zhang等[23]報道表觀遺傳沉默或轉錄后修飾可能在PTEN表達中發揮主要作用,PTEN缺陷可能引起RAD51下調,形成HRD表型。雖然前列腺癌、子宮內膜樣癌的PTEN表達缺失患者對PARP抑制劑敏感性較高,但HGSOC的PTEN表達缺失患者對PARP抑制劑反應不佳[6,24]。另外,PTEN表達缺失的HGSOC患者ER表達下調,表現為化療耐藥,預后較差,PTEN缺失與CCNE1擴增互斥[22-23]。根據以上特征,考慮將PTEN表達缺失作為HGSOC的一個亞組。

免疫組化是PTEN表達缺失的主要檢測方法,PTEN可呈異質性表達,暫無統一的判讀標準。NGS可檢測PTEN基因是否存在突變或缺失,可作為免疫組化法評估腫瘤PTEN狀態的補充[23-24]。PTEN與相關PI3K/AKT信號通路可作為治療藥物研究的方向,對標準治療無效的晚期卵巢癌患者可從PI3K抑制劑中獲益[25]。

5 RB1的致病機制與臨床病理特征

抑癌基因RB1編碼Rb蛋白,Rb蛋白結合E2F轉錄因子,阻滯細胞周期進展。當RB1突變或失活時,對細胞周期的阻滯作用減弱,細胞增生失控導致腫瘤的發生[26]。在HGSOC病例中,RB1基因缺失、突變分別占比8%、2%,兩者均可導致Rb蛋白表達缺失[2]。

RB1表達缺失與患者生存期有關,一項納入鉑類化療HGSOC病例的研究發現,無進展生存期和總生存期長的HGSOC患者中RB1表達缺失頻率更高,且RB1信使RNA水平越低,患者總生存期越長[27]。另外,RB1表達缺失常出現在不宜手術且無進展生存期長的患者中,表明RB1表達缺失患者的化療敏感性可能更高;RB1表達缺失并同時有HRD的患者生存期更長,提示RB1在HRR中可能發揮作用[27]。目前,免疫組化是RB1的主要檢測方法,反映Rb蛋白在組織中的表達;也可用NGS對RB1基因突變、甲基化等進行檢測[2,27]。RB1表達缺失患者對化療有較高敏感性,應積極進行以鉑類藥物的化療方案。另外,RB1可作為HGSOC的治療靶點,如CDK4/6抑制劑可降低E2F表達,觸發抗腫瘤免疫,可能為RB1表達缺失患者提供治療療效[28]。

6 NF1失活的致病機制與靶向藥物研發

NF1基因屬于抑癌基因,編碼神經纖維瘤蛋白,調節細胞內活化RAS蛋白水平,NF1突變或缺失可導致神經纖維瘤蛋白功能缺失,細胞內活化RAS蛋白維持在一定水平,RAS/RAF/MEK/ERK信號通路和PI3K/AKT信號通路持續激活,最終導致細胞過度增殖和腫瘤形成[29]。

約12%的HGSOC病例存在NF1功能缺失,NF1失活與CCNE1高水平擴增互斥,同時發生RB1丟失,在BRCA1/2突變與野生型HGSOC中的發生頻率相似。NF1失活HGSOC患者的生存期介于BRCA1/2突變(預后佳)和CCNE1高水平擴增(預后差)的HGSOC之間[2,30]。在NF1相關的治療研究中,RAS/RAF/MEK/ERK信號通路相關靶點可作為治療藥物開發的主要靶標,如MEK抑制劑司魯美替尼可逆轉HGSOC的抗雌激素耐藥[30]。體外實驗表明,BET抑制劑可拮抗有NF1缺陷的HGSOC患者對曲美替尼的耐藥性,BET抑制劑有望成為NF1突變HGSOC患者治療的新方向[31]。NGS是檢測NF1基因是否出現變異的重要方法[32]。最近有研究通過免疫組化檢測NF1缺失,發現17.4%HGSOC中檢測到NF1表達缺失,其中11%為亞克隆缺失[33]。

7 MYC擴增的致病機制與靶向藥物研發

核蛋白類癌基因MYC在>20%的HGSOC中存在擴增[2,34],編碼產物c-MYC是作用廣泛的轉錄因子,與MAX形成同源二聚體,并與E-box上的啟動子區域結合,調控與細胞生長和增殖有關的基因轉錄,當MYC發生擴增或染色體易位時MYC調控失常,導致腫瘤的發生和發展[34]。

MYC擴增對HGSOC預后的影響仍未明確[34],應用免疫組化檢測可初步判斷MYC是否存在過表達,采用DNA雜交、FISH和NGS等檢測MYC是否擴增[35]。以MYC為靶點治療HGSOC的藥物已取得一定進展,如JQ1(BET抑制劑)抑制MYC基因轉錄的上游BRD4蛋白,從而抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡[34]。

8 MMR基因突變的致病機制和免疫治療

MMR是DNA修復機制之一,可移除DNA復制過程中整合錯誤的核苷酸,防止子代細胞出現基因突變。當MMR基因突變或功能缺失時,微衛星序列/簡單重復序列的復制錯誤無法被MMR修復,導致MSI并誘導腫瘤發生[3]。0.4%～2.6%的HGSOC中出現錯配修復缺陷(mismatch repair deficiency, dMMR)/MSI[36-38]。MMR基因突變包括體系和胚系突變,其中胚系突變與Lynch綜合征有關[38]。目前還缺少HGSOC的dMMR/MSI獨立的隊列研究。

dMMR/MSI檢測有3種方法:(1)免疫組化是主要的檢測方法,當4種MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)均呈核陽性時,判讀為錯配修復功能正常(mismatch repair deficiency proficiency, pMMR),當至少1種蛋白表達缺失時則為dMMR[39]。(2)PCR檢測微衛星位點,結果有微衛星高度不穩定、低度不穩定和微衛星穩定[39]。然而,不同類型腫瘤的MSI檢出率受檢測位點的影響,目前尚缺乏關于HGSOC特異MSI位點的研究[36,40]。(3)NGS檢測可提供MMR基因胚系突變、腫瘤突變負荷等多種信息,但結果缺乏統一的解讀標準[41]。

dMMR/MSI腫瘤對免疫檢查點抑制劑敏感性較高,免疫檢查點抑制劑如PD-1/PD-L1抑制劑等可延長多種腫瘤患者的總生存期[3,38]。然而,關于dMMR/MSI的HGSOC免疫治療報道較少[42]。鑒于以往研究中免疫檢查點抑制劑對HGSOC患者療效較小,dMMR/MSI檢測可能成為指導免疫檢查點抑制劑用藥的依據[43]。

9 小結

HGSOC是多種基因變異導致的腫瘤,除上述基因變異外,其他基因如CDKN2A、PAX8、WT-1、AKT2和RAD51C/D等均與HGSOC的致病機制有關。分析上述基因變異與腫瘤組織學特征、臨床表現、化療的敏感性和預后的關系,有助于建立HGSOC遺傳學變異框架,更好地進行疾病的預測、診斷和靶向藥物的研究。