子宮內(nèi)膜樣癌中KIFC1的表達(dá)及臨床意義

鄧 濤,溫媛媛,何 慧,錢立勇

中心體聚集擴(kuò)增可引起染色體不穩(wěn)定和細(xì)胞周期失調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移。這種擴(kuò)增現(xiàn)象僅發(fā)生在癌細(xì)胞中,作為特殊癌細(xì)胞靶向治療已引起學(xué)者們廣泛關(guān)注[1]。中心體聚集涉及多種蛋白,與其關(guān)系密切,對多余中心體的聚集至關(guān)重要,可使偽雙極紡錘體形成,驅(qū)動染色體錯誤分離形成非整倍體,促使致癌作用的啟動和(或)加速[2]。研究表明,KIFC1在前列腺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌和胃癌中高表達(dá),與不良預(yù)后有關(guān)[3-9]。KIFC1在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào),并調(diào)節(jié)致癌信號級聯(lián),是潛在的腫瘤特異性治療靶點。目前,文獻(xiàn)報道KIFC1在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)和作用較少。本文旨在探討KIFC1在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)和臨床意義,分析其與預(yù)后的關(guān)系,為子宮內(nèi)膜樣癌的靶向治療和預(yù)后評估提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年1月～2022年12月我院病理科確診的子宮內(nèi)膜樣癌組織95例,癌旁正常子宮內(nèi)膜組織30例,均未接受藥物和放化療等相關(guān)治療。根據(jù)WHO女性生殖腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)和FIGO分期系統(tǒng)明確診斷,其中子宮內(nèi)膜樣癌患者平均年齡55.27歲,另檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中子宮內(nèi)膜樣癌540例(http://www.oncolnc.org)進(jìn)行驗證分析。本實驗經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn),患者均知情同意。

1.2 主要試劑兔抗人KIFC1單克隆抗體購自美國Abcam公司,SP試劑盒、DAB顯色劑和β-actin抗體均購自北京中杉金橋公司,PCR引物購自上海生工公司,FastQuant RT Kit試劑盒購自北京天根生化公司,GO Taq qPCR Master Mix試劑盒購自美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化法 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,4 μm厚切片,常規(guī)烤片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,檸檬酸修復(fù)液高溫高壓抗原修復(fù)2 min。免疫組化采用SP法染色,觀察KIFC1在子宮內(nèi)膜樣癌和癌旁子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)。每張切片隨機選取5個高倍視野,每個視野計數(shù)200個細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞著色強度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分。(1)按細(xì)胞著色強度評分:無著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,黃褐色為3分。(2)按陽性細(xì)胞百分比評分:無陽性細(xì)胞為0分,≤10%為1分,11%～50%為2分,51%～80%為3分,>80%為4分。兩項得分相乘:≥3分為陽性,<3分為陰性。

1.3.2qRT-PCR檢測 本實驗提取30對子宮內(nèi)膜樣癌和癌旁正常子宮內(nèi)膜組織總RNA,利用FastQuant RT Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,應(yīng)用GO Taq qPCR Master Mix試劑盒在ABI 7500上進(jìn)行qRT-PCR分析。實驗至少重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。KIFC1上游引物:5’-GACGCCCTGCTTCATCTG-3’,下游引物:5’-CCAGGTCCACAAGACTGAGG-3’;內(nèi)參18S上游引物:5’-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3’;下游引物:5’-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3’。

1.3.3Western blot檢測 將30對新鮮子宮內(nèi)膜樣癌組織和對應(yīng)的癌旁正常子宮內(nèi)膜組織剪碎、勻漿、加入裂解液充分裂解,離心(4 ℃、15 000 r/min、30 min),提取上清為總蛋白。Bradford法測定蛋白濃度,每孔上樣量為80 μg,聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、轉(zhuǎn)印、脫脂奶粉封閉2 h,KIFC1一抗(稀釋比為1 ∶800)4 ℃孵育過夜,第2天洗膜后37 ℃孵育二抗2 h,ECL發(fā)光。結(jié)果經(jīng)自動凝膠成像分析儀采集,β-actin做內(nèi)參,對目的蛋白進(jìn)行灰度值比值測定。每組結(jié)果相同條件至少重復(fù)3次,取平均值。

1.4 隨訪患者采用門診復(fù)查和電話隨訪,平均每6個月隨訪1次。隨訪截至2022年12月31日,或以患者死亡時間為止,刪失者均納入生存分析。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜組織中KIFC1蛋白的表達(dá)KIFC1蛋白在癌旁正常子宮內(nèi)膜組織中的陽性率為13.33%(4/30),在子宮內(nèi)膜樣癌中的陽性率為61.05%(58/95),兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.769,P<0.001,圖1)。選取的95例子宮內(nèi)膜樣癌中,高分化52例,中低分化癌43例,<1/2肌層浸潤64例,≥1/2肌層浸潤31例,FIGO I+Ⅱ期72例,Ⅲ+Ⅳ期23例,伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例,不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)KIFC1表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣癌肌層浸潤深度、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P均<0.05),與患者年齡和組織學(xué)分化程度均無關(guān)(P均>0.05,表1)。

表1 子宮內(nèi)膜樣癌組織中KIFC1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

AB

2.2 子宮內(nèi)膜組織中KIFC1的表達(dá)量qRT-PCR結(jié)果顯示,在癌旁正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜樣癌中KIFC1 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.00±0.29和2.99±0.59,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.476,P<0.001,圖2A)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),KIFC1 mRNA在540例子宮內(nèi)膜樣癌中高表達(dá)(P<0.001,圖2B),與本組PCR檢測結(jié)果一致。

圖2 子宮內(nèi)膜樣癌和癌旁正常子宮內(nèi)膜組織中KIFC1 mRNA和蛋白表達(dá)：A.qRT-PCR法檢測KIFC1 mRNA的表達(dá),*P<0.001;B.TCGA數(shù)據(jù)庫比較子宮內(nèi)膜樣癌組織與癌旁正常子宮內(nèi)膜組織中KIFC1 mRNA的表達(dá)量,*P<0.001;C.Western blot法檢測KIFC1蛋白表達(dá);C1、C2、C3. 子宮內(nèi)膜樣癌組織;N1、N2、N3. 癌旁正常子宮內(nèi)膜組織

Western blot結(jié)果顯示,KIFC1蛋白在癌旁正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜樣癌中相對表達(dá)量分別為0.72±0.17和1.70±0.36,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.354,P<0.001,圖2C)。

2.3 生存分析本組生存分析顯示,KIFC1陽性患者中位生存時間為93個月;KIFC1陰性患者中位生存時間為120個月。KIFC1陽性患者生存時間與OS顯著低于陰性患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.012,P=0.008,表2,圖3A)。本組結(jié)果顯示:KIFC1蛋白表達(dá)、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者的生存時間相關(guān)(P均<0.05,表2),Cox回歸分析結(jié)果表明KIFC1是子宮內(nèi)膜樣癌患者預(yù)后的危險因素(P=0.045,表3)。本組與TCGA數(shù)據(jù)庫中540例子宮內(nèi)膜樣癌組織生存分析結(jié)果一致(χ2=5.398,P=0.020,圖3B)。

表2 子宮內(nèi)膜樣癌患者OS的Logrank回歸分析

表3 子宮內(nèi)膜樣癌患者OS的Cox回歸分析

圖3 A.KIFC1表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣癌患者累積生存率的關(guān)系;B.TCGA數(shù)據(jù)庫中KIFC1 mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣癌患者累積生存率的關(guān)系

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是全球常見的婦科惡性腫瘤,最常見的病理類型是子宮內(nèi)膜樣癌,發(fā)病率和病死率均呈逐年升高趨勢。老年患者絕經(jīng)后再次有陰道出血癥狀有助于該病的早期診斷,多數(shù)患者可通過子宮切除后治愈,然而晚期患者預(yù)后較差[10-11]。因此,尋找有效的生物學(xué)標(biāo)志物對提高早期檢出率和靶向治療至關(guān)重要。

1992年,KIFC1基因首次在人類主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ基因的著絲粒片段中被發(fā)現(xiàn)[12]。KIFC1也被稱為HSET,是黑腹果蠅的直系同源物,屬于驅(qū)動蛋白14家族蛋白中的一員。在哺乳動物中,驅(qū)動蛋白14家族包含3個成員:KIFC1、KIFC2和KIFC3。KIFC1由663個氨基酸殘基組成,廣泛表達(dá)于骨髓、淋巴結(jié)、皮膚、脾臟、睪丸、膀胱和胃腸道系統(tǒng),主要參與哺乳動物細(xì)胞中的微管交聯(lián)和紡錘體組裝,也在運輸囊泡和細(xì)胞器、精子發(fā)生和神經(jīng)元遷移中發(fā)揮重要作用。最近研究表明,KIFC1能聚集多余中心體維持癌細(xì)胞的存活,其在多種腫瘤中過表達(dá),但對正常細(xì)胞的有害作用和抑制作用較小,提示KIFC1的靶向治療或許在選擇性抗腫瘤措施中具有重大的研究前景。因此,KIFC1已成為現(xiàn)階段具有吸引力的癌癥特異性標(biāo)志物[13-14]。

既往研究顯示,KIFC1在卵巢癌組織中高表達(dá),其通過調(diào)節(jié)CNEPE調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。KIFC1在肝細(xì)胞癌中高表達(dá),并與腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量和腫瘤大小有相關(guān)性。此外,KIFC1過表達(dá)的患者OS和無復(fù)發(fā)生存率較低,沉默KIFC1的表達(dá)能顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長[16]。KIFC1在前列腺癌的細(xì)胞核中也有豐富的表達(dá),使用AZ82降低KIFC1的表達(dá)后,可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖,并且KIFC1 mRNA的表達(dá)隨著前列腺癌Gleason評分和腫瘤分期的增加而增加,KIFC1在原發(fā)腫瘤中的表達(dá)高于癌旁正常組織,在轉(zhuǎn)移性病變中的表達(dá)高于原發(fā)腫瘤,KIFC1 mRNA的高表達(dá)與前列腺癌患者無復(fù)發(fā)生存率較低相關(guān)。這些結(jié)果表明,KIFC1高表達(dá)與前列腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān),可作為前列腺癌患者的預(yù)后指標(biāo)[3,17]。Sun等[18]對11項腫瘤的研究和2 424例患者的薈萃分析,闡明KIFC1過表達(dá)對腫瘤患者OS、無復(fù)發(fā)生存期和腫瘤臨床病理特征的影響,KIFC1過表達(dá)與腫瘤惡性生物學(xué)行為、較低生存期和無復(fù)發(fā)生存期密切相關(guān)。本組結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜樣癌中KIFC1蛋白陽性率顯著升高,KIFC1的mRNA、蛋白表達(dá)量在子宮內(nèi)膜樣癌組織中顯著升高;TCGA數(shù)據(jù)庫顯示KIFC1 mRNA在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)高于癌旁正常子宮內(nèi)膜,兩者結(jié)果一致推測KIFC1在子宮內(nèi)膜樣癌中作為促癌因子發(fā)揮作用。本組還發(fā)現(xiàn),KIFC1與子宮內(nèi)膜樣癌的肌層浸潤深度、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān),推測KIFC1在子宮內(nèi)膜樣癌浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促癌作用。為了進(jìn)一步分析KIFC1與患者預(yù)后的關(guān)系,本組通過生存分析發(fā)現(xiàn),KIFC1陽性、高FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的生存率降低;與KIFC1陰性者相比,KIFC1陽性患者的中位生存時間縮短,累積OS下降。Cox回歸分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),KIFC1陽性是子宮內(nèi)膜樣癌患者的危險因素,推測KIFC1與子宮內(nèi)膜樣癌患者預(yù)后關(guān)系密切,KIFC1陽性提示患者預(yù)后不良。因此,KIFC1可作為臨床評估子宮內(nèi)膜樣癌患者預(yù)后的參考指標(biāo),與TCGA數(shù)據(jù)庫中生存分析結(jié)果一致。

綜上所述,子宮內(nèi)膜樣癌中KIFC1高表達(dá)與腫瘤肌層浸潤深度、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。臨床試驗需擴(kuò)大樣本量以便進(jìn)一步分析具體作用機制,為患者的個體化治療提供更有力的科學(xué)依據(jù)。