MCM5在卵巢癌中的作用及機(jī)制分析

陳 冬,張明薇,孫菲菲,李 麗,

2022年我國(guó)卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)腫瘤的第三位,病死率高,嚴(yán)重危害女性健康。研究卵巢癌的發(fā)生機(jī)制,有助于早期發(fā)現(xiàn)和有效預(yù)防,為患者提供潛在的治療靶點(diǎn)。微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance, MCM)家族是從古老低等生物到真核生物中廣泛存在、高度保守的蛋白質(zhì)[1],在真核生物中MCM2～7形成異六聚體,與加載器Cdt1、起始識(shí)別復(fù)合物ORC相互作用,發(fā)揮解旋酶作用,激活起始復(fù)制源,啟動(dòng)DNA復(fù)制[2-5]。MCM5在多種腫瘤中高表達(dá),與預(yù)后不良相關(guān)[6-8]。其在惡性腫瘤中的研究均為蛋白表達(dá)分析,缺乏相應(yīng)機(jī)制研究。本課題組前期發(fā)現(xiàn),MCM5在子宮內(nèi)膜漿液性癌中呈彌漫強(qiáng)表達(dá),且與TP53突變相關(guān),過(guò)表達(dá)MCM5促進(jìn)子宮漿液性癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。高級(jí)別漿液性卵巢癌與子宮內(nèi)膜漿液性癌均以TP53突變?yōu)樘攸c(diǎn)[9],組織學(xué)和生物學(xué)行為相似,MCM5在卵巢癌中是否也發(fā)揮同樣的作用值得深入分析。本文著重探討MCM5在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和功能,分析作用機(jī)制和臨床意義,為卵巢癌的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020～2021年山東大學(xué)齊魯醫(yī)院行手術(shù)治療的118例卵巢癌組織,患者年齡38～80歲,中位年齡59歲。本組高級(jí)別漿液性癌95例,低級(jí)別漿液性癌7例,子宮內(nèi)膜樣癌5例,透明細(xì)胞癌6例,黏液性癌5例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均知情同意。

1.2 材料與試劑卵巢癌細(xì)胞系HEY、SK-OV-3來(lái)自山東大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。MCM5小干擾序列由上海博尚公司合成;CCK-8試劑盒購(gòu)自Beyotime公司;ER、PR、p53、Ki67單克隆抗體和SP兩步法試劑盒,均購(gòu)自北京中杉金橋公司。AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自上海貝博生物公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息學(xué)分析 TCGA癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)集從http://gdac.broadinstitute.org/下載,收集426例卵巢癌和88例正常卵巢組織臨床病理資料。GSEA分析使用GEO數(shù)據(jù)集GSE9891(280例不同級(jí)別卵巢腫瘤)和GSE12172(90例卵巢腫瘤),從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載。

1.3.2免疫組化與結(jié)果判斷 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,烤片,脫蠟和水化,采用免疫組化SP 兩步法染色。切片高壓修復(fù)5 min,3% H2O2抗原修復(fù),山羊血清封閉,一抗4 ℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗后滴加二抗,室溫孵育30 min,DAB顯色,蘇木精染色,脫水,透明,封固。

ER、PR、p53和Ki67均為細(xì)胞核著色,>10%的腫瘤細(xì)胞著色判為ER、PR陽(yáng)性。p53腫瘤細(xì)胞呈細(xì)胞核彌漫強(qiáng)陽(yáng)性或均陰性為“突變型”,散在、低至中等強(qiáng)度著色為“野生型”。MCM5陽(yáng)性定位于細(xì)胞核,采用H-score法進(jìn)行判讀[10]:0～3分為陰性,4～9分為陽(yáng)性,其中4～6分為低表達(dá),7～9分為高表達(dá)。

1.3.3Western blot、CCK-8和EDU實(shí)驗(yàn) Western blot檢測(cè): 經(jīng)蛋白提取,測(cè)定濃度,上樣后電泳轉(zhuǎn)膜、封閉、電泳,一抗過(guò)夜孵育,二抗孵育1 h,顯影。CCK-8法:細(xì)胞置于96孔板內(nèi),加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。EDU實(shí)驗(yàn):按細(xì)胞6 000個(gè)/孔加入EDU工作液,孵育2 h,固定、甘氨酸孵育、加通透液后,放入Click-T反應(yīng)混合物,DAPI染色,拍照、分析。

1.3.4克隆形成、Transwell小室、劃痕實(shí)驗(yàn) 克隆形成實(shí)驗(yàn):細(xì)胞800個(gè)/孔,觀察克隆生長(zhǎng)情況,標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定15 min,棄上清,2.5%結(jié)晶紫避光染色10 min,實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[11]。Transwell小室實(shí)驗(yàn):檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移能力,實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[12]。劃痕實(shí)驗(yàn):將處理后的細(xì)胞均勻種植在6孔板中,劃痕后進(jìn)行拍照,實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù) 采用凋亡檢測(cè)試劑盒,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞,加入培養(yǎng)基重懸,4 ℃經(jīng)800 r/min離心5 min;使用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次,離心后棄上清,加入400 μL Binding Buffer和5 μL Annexin V-FITC,4 ℃避光孵育30 min;加入10 μL PI染色液并混勻,4 ℃避光孵育5 min,用400目濾網(wǎng)過(guò)濾后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Graphpadprism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn),應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)估相關(guān)性和Kaplan-Meier法分析預(yù)后。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析卵巢癌中MCM5 mRNA的表達(dá)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析426例卵巢癌和88例正常卵巢組織,與正常卵巢組織相比,卵巢癌中MCM5 mRNA水平明顯升高(P=0.007 8,圖1A)。在GEO數(shù)據(jù)集GSE9891中分析280例不同級(jí)別卵巢腫瘤,結(jié)果顯示:不同分級(jí)卵巢腫瘤中MCM5 mRNA的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005 4,P=0.021 1),卵巢腫瘤分級(jí)越高,MCM5 mRNA表達(dá)水平越高。GSE9891數(shù)據(jù)集中包括18例卵巢低度惡性潛能腫瘤(即交界性腫瘤)和262例卵巢癌,卵巢低度惡性潛能腫瘤中MCM5 mRNA表達(dá)水平顯著低于卵巢癌(P=0.008 4)。在GSE12172數(shù)據(jù)集中分析90例卵巢癌,與卵巢低度惡性潛能腫瘤(n=30)相比,卵巢癌(n=60)中MCM5 mRNA表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 1,圖1B～D)。

圖1 生物信息學(xué)分析卵巢癌中MCM5 mRNA的表達(dá)：A.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MCM5 mRNA在卵巢癌中的表達(dá);B.不同級(jí)別卵巢腫瘤中MCM5 mRNA的表達(dá);C. GSE9891數(shù)據(jù)庫(kù)中MCM5 mRNA在卵巢癌與卵巢低度惡性潛能腫瘤中的比較;D. GSE12172數(shù)據(jù)庫(kù)中MCM5 mRNA在卵巢癌與卵巢低度惡性潛能腫瘤中的比較;*P<0.05,**P<0.01

2.2 卵巢癌中MCM5表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組118例卵巢癌中,p53突變型92例(77.97%,表1)。高級(jí)別漿液性癌呈乳頭狀、腺樣生長(zhǎng),有顯著核異型性(圖2A);低級(jí)別漿液性癌的腫瘤細(xì)胞形成微乳頭結(jié)構(gòu),輕至中度核異型性(圖2B);子宮內(nèi)膜樣癌的腫瘤性腺體呈腺管狀、篩狀(圖2C);透明細(xì)胞癌呈微囊狀、乳頭狀生長(zhǎng),乳頭軸心有玻璃樣變,腫瘤細(xì)胞呈鞋釘狀(圖2D);黏液性癌腫瘤性腺體融合,呈膨脹性浸潤(rùn)(圖2E);正常輸卵管上皮為單層柱狀上皮(圖2F)。MCM5在輸卵管上皮組織中不表達(dá),在不同組織學(xué)類(lèi)型的卵巢癌中有不同程度的表達(dá)(圖2G～L)。MCM5在卵巢癌中陽(yáng)性率為48.3%(57/118),與正常輸卵管組織(0/6)相比,卵巢癌中MCM5表達(dá)明顯升高(P=0.004 2)。同時(shí),MCM5在高級(jí)別漿液性癌中呈彌漫強(qiáng)表達(dá),在其他類(lèi)型多為弱至中等強(qiáng)度表達(dá)。MCM5與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.002 2),與p53突變型(P=0.000 3)、Ki67增殖指數(shù)高相關(guān)(P=0.003 2,表1)。MCM5與ER在95例高級(jí)別漿液性癌中呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.000 3),與Ki67增殖指數(shù)高明顯相關(guān)(P=0.000 3),與患者年齡、FIGO分期、PR表達(dá)均無(wú)明顯相關(guān)性(表2)。本組結(jié)果顯示,MCM5高表達(dá)與卵巢癌ER表達(dá)水平低、Ki67增殖指數(shù)高和腫瘤惡性程度高均相關(guān)。

表1 118例卵巢癌中MCM5表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表2 95例高級(jí)別漿液性癌中MCM5表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

ABCDEFGHIJKL

2.3 干擾MCM5對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響采用CCK-8、EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCM5對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響,應(yīng)用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。在卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和Hey細(xì)胞中,分別使用2條不同的小干擾序列敲低MCM5。EDU實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比干擾MCM5后卵巢癌細(xì)胞增殖能力明顯降低(圖3A～C)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,干擾MCM5后SK-OV-3和Hey細(xì)胞活性明顯降低(圖3D、E)。上述結(jié)果表明,干擾MCM5降低卵巢癌細(xì)胞增殖能力。平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示,MCM5干擾組細(xì)胞克隆形成能力明顯低于對(duì)照組(圖3F、G),表明干擾MCM5抑制細(xì)胞平板克隆形成。

圖3 干擾MCM5抑制卵巢癌細(xì)胞增殖能力：A.EDU實(shí)驗(yàn):在SK-OV-3細(xì)胞中干擾MCM5檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞增殖;B.EDU實(shí)驗(yàn):在Hey細(xì)胞中干擾MCM5檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞增殖;C.直方圖;D. CCK-8實(shí)驗(yàn):在SK-OV-3細(xì)胞中干擾MCM5檢測(cè)細(xì)胞活性;E.CCK-8實(shí)驗(yàn):在Hey細(xì)胞中干擾MCM5檢測(cè)細(xì)胞活性;F. 平板克隆實(shí)驗(yàn):在SK-OV-3和Hey細(xì)胞中干擾MCM5檢測(cè)細(xì)胞克隆形成;G.直方圖;*P<0.05,**P<0.01,NC:陰性對(duì)照,siMCM5-1#與siMCM5-2#分別代表2條靶向MCM5的不同的小干擾序列

2.4 干擾MCM5對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCM5對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果顯示SK-OV-3和Hey細(xì)胞中,干擾MCM5后腫瘤細(xì)胞劃痕愈合能力明顯低于對(duì)照組(P=0.004、P=0.021,圖4A、B)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示,MCM5干擾組Transwell小室細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組(P=0.002 1、P=0.041 4、P=0.003 2、P=0.021 4),表明干擾MCM5抑制卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲(圖4C、D)。

圖4 干擾MCM5抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移能力：A. 劃痕實(shí)驗(yàn):在SK-OV-3和Hey細(xì)胞中干擾MCM5檢測(cè)細(xì)胞遷移;B.直方圖;C. Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn):干擾MCM5檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲;D. 直方圖;*P<0.05,**P<0.01,NC:陰性對(duì)照,ns:無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.5 干擾MCM5對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響為進(jìn)一步分析MCM5促進(jìn)卵巢癌惡性進(jìn)展的機(jī)制,本組進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。在SK-OV-3和Hey細(xì)胞中,干擾MCM5后細(xì)胞凋亡顯著升高,提示MCM5可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡影響卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)(圖5)。

圖5 干擾MCM5促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡:在SK-OV-3和Hey細(xì)胞中干擾MCM5后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.6 卵巢癌中MCM5表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系使用在線分析網(wǎng)站Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析,采用50%作為截?cái)嘀怠＝Y(jié)果顯示,MCM5低表達(dá)組中位無(wú)進(jìn)展生存期為24.7個(gè)月,高表達(dá)組為19個(gè)月(P=0.014 1,圖6A),MCM5高表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存期比低表達(dá)者短。此外,TP53突變型卵巢癌中,MCM5低表達(dá)組中位無(wú)進(jìn)展生存期為20.0個(gè)月,MCM5高表達(dá)組為16.8個(gè)月,MCM5高表達(dá)與無(wú)進(jìn)展生存期短相關(guān)(P=0.007 5,圖6B)。在TP53野生型腫瘤中,MCM5高表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性,中位無(wú)進(jìn)展生存期分別為23.1和15.5個(gè)月(P=0.065 1,圖6C)。上述結(jié)果,提示MCM5高表達(dá)患者預(yù)后較差。

圖6 卵巢癌中MCM5高表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系：A.卵巢癌中MCM5高表達(dá)組與低表達(dá)組患者無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系;B.TP53突變型卵巢癌中,MCM5高表達(dá)組與低表達(dá)組患者無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系;C. TP53野生型卵巢癌中,MCM5高表達(dá)組與低表達(dá)組患者無(wú)進(jìn)展生存期的關(guān)系

3 討論

卵巢癌患者就診時(shí)多數(shù)已為晚期,術(shù)后2～3年常發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,化療易耐藥,晚期患者5年生存率不足30%。目前,學(xué)者們對(duì)卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚,缺乏有效的早期診斷和治療策略。

卵巢癌主要分為5種組織學(xué)亞型,即高級(jí)別漿液性癌、低級(jí)別漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌和黏液性癌[13-14]。卵巢癌中以高級(jí)別漿液性癌最為常見(jiàn),該類(lèi)型以TP53基因突變、基因組高度不穩(wěn)定性為特點(diǎn),生長(zhǎng)迅速,侵襲性強(qiáng),預(yù)后較差,5年總生存率僅40%。

本組采用生物信息學(xué)分析和免疫組化法等分析卵巢癌中MCM5 mRNA和蛋白水平的變化,結(jié)果顯示兩者在卵巢癌中的表達(dá)均高于正常輸卵管上皮,其中以高級(jí)別漿液性癌升高最為明顯,提示MCM5或在卵巢癌尤其是高級(jí)別漿液性癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。同時(shí),本組發(fā)現(xiàn)MCM5高表達(dá)患者比低表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存期短,在TP53突變的卵巢癌中,該趨勢(shì)更為明顯。TP53突變的卵巢癌主要為高級(jí)別漿液性癌,提示MCM5高表達(dá)卵巢癌患者預(yù)后不良。此外,MCM5高表達(dá)與腫瘤Ki67增殖指數(shù)高、ER低表達(dá)相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)MCM5高表達(dá)與患者預(yù)后差相關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究也提示MCM5高表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后不良相關(guān),Wang等[15]研究顯示MCM5高表達(dá)急性髓性白血病患者預(yù)后不良;Xiong等[16]發(fā)現(xiàn)MCM5可以預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者生存期。也有文獻(xiàn)報(bào)道,MCM復(fù)合物可能是卵巢癌患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物[17-18]。

為了進(jìn)一步分析MCM5作用和功能,本組進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)選擇高表達(dá)MCM5的卵巢癌SK-OV-3和Hey細(xì)胞系。干擾MCM5后,卵巢癌細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞活性、克隆形成能力和侵襲遷移能力均明顯降低,提示MCM5可能通過(guò)調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。MCM5參與DNA復(fù)制起始,在DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用,并影響細(xì)胞周期進(jìn)程。MCM5在靜止期細(xì)胞中表達(dá)極少,G1期表達(dá)開(kāi)始增加,G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)達(dá)到峰值,當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂晚期、G0期或發(fā)生衰老時(shí),水平逐漸下降。一旦細(xì)胞進(jìn)入S期,多種機(jī)制阻止新的MCM5加載,防止過(guò)度復(fù)制導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。多種機(jī)制導(dǎo)致的MCM5表達(dá)升高,均可引起過(guò)度復(fù)制,從而導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖和基因組高度不穩(wěn)定性,因此MCM5高表達(dá)腫瘤常為高度惡性,存在染色體不穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾MCM5促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提示MCM5可能同時(shí)通過(guò)調(diào)控凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。然而,MCM5通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)卵巢癌侵襲、遷移,需要深入分析。有研究表明,MCM5通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)展[19],且可通過(guò)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[20]。

Sharma等[21]發(fā)現(xiàn)MCM5在膀胱癌的初步診斷中具有良好的準(zhǔn)確性,Stockley等[22]報(bào)道MCM5是兼具敏感性和特異性的新腫瘤標(biāo)志物,可用于檢測(cè)尿液中的卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞。本組顯示與正常卵巢組織和輸卵管上皮相比,卵巢癌組織中MCM5表達(dá)明顯升高,且與其他亞型相比,高級(jí)別漿液性癌中呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性,提示免疫組化檢測(cè)p53和MCM5可用于鑒別卵巢癌組織學(xué)類(lèi)型和高級(jí)別漿液性癌的早期診斷,并可作為卵巢癌潛在預(yù)后標(biāo)志物。由于免疫組化技術(shù)簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng),在臨床診斷的應(yīng)用中更容易推廣。

綜上所述,MCM5在卵巢癌尤其是高級(jí)別漿液性癌中表達(dá)顯著升高,MCM5高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。MCM5通過(guò)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮促癌作用,有望成為卵巢癌預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。