基于β-catenin/Slug信號通路表達探討LPCAT1對子宮頸癌生物學行為的影響

時春麗,周桂華,陳 煒,吳曉玲,陸 宏,林春華

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤,也是女性癌癥患者死亡的主要原因[1]。全球每年子宮頸癌新發患者約470 000例,其中威脅患者生命約28 000例[2]。HPV持續感染是導致子宮頸癌的發生、發展的關鍵因素,最近有研究證實HPV的單一感染不足以導致腫瘤生長[3]。越來越多的證據表明,許多遺傳因素可能參與了子宮頸癌的發病機制[4]。LPCAT1是與磷脂酰膽堿代謝相關的酶,可調節磷脂酰膽堿的組成,易使多不飽和脂肪酸沉積[5]。文獻報道,LPCAT1在許多不同腫瘤中有致癌功能[6],LPCAT1通過PI3K/AKT信號通路促進肺腺癌的發生、發展,其與EMT有關[7]。臨床研究發現,LPCAT1在子宮頸癌中過表達與患者不良預后相關,LPCAT1可能是子宮頸癌預后生物學標志物和治療靶點[8]。然而,目前LPCAT1在子宮頸癌中的致癌作用尚未完全闡明。本文旨在探討LPCAT1在子宮頸癌細胞侵襲、轉移和生長中的作用,分析其是否與激活EMT有關,以改善患者的預后。

1 材料與方法

1.1 細胞培養人正常子宮頸上皮細胞系(HcerEpic)和3種人子宮頸癌細胞系(Hela、SiHa和CaSki),均購自美國ATCC公司。用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中(美國Gibco公司)培養細胞。

1.2 體外轉染和分組將Hela細胞分為sh-NC組和sh-LPCAT1組,兩組細胞經sh-NC、sh-LPCAT1轉染,由上海吉瑪制藥公司使用pGPU6/GFP/Neo載體合成LPCAT1-shRNAs。sh-LPCAT1:5′-CACTGCC ATTGATGCGGATG-3′和sh-NC:5′-GACTTCAACAGC AACTCCCACTC-3′。使用Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)將質粒轉染到Hela細胞。將細胞置于含有遺傳霉素的完全優化MEM培養基(美國Gibco公司)中培養30天,選擇陽性細胞。

將SiHa細胞分為載體(Vector)組和LPCAT1組,由上海吉瑪制藥公司構建pIRES2-LPCAT1質粒:正向5′-ACTACGTAGCTAGCGCGCGCAGCATG-3′和反向5′-CACACCGTCGACGTATGTACAAGACT C-3′。引物用于擴增全長人LPCAT1編碼序列,通過Nhe I和Sac I位點將其克隆到pIRES2-AcGFP載體(美國Clontech公司)中。使用Lipofectamine 3000試劑,將質粒瞬時轉染到SiHa細胞中。

為了進一步證實LPCAT1通過激活β-catenin/Slug途徑誘導EMT發生的假設,本組采用β-catenin/Slug信號特異性抑制劑FH535(美國MedChemExpress公司)處理LPCAT1過表達的SiHa細胞。將SiHa細胞分為:對照組、LPCAT1組、LPCAT1+FH535組和FH535組。對照組不做任何處理,LPCAT1組、LPCAT1+FH535組SiHa細胞用Lipofectamine 3000試劑,將pIRES2-LPCAT1質粒轉染細胞上調LPCAT1表達。然后,LPCAT1+FH535組、FH535組細胞用FH535(30 μmol/L溶解在DMSO中,于-20 ℃中儲存)處理,24 h后測定SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲情況。

1.3 細胞增殖將處理后的細胞接種到96孔板中,培養24～72 h后,將細胞與CCK-8溶液(上海Beyotime公司)培養1 h,在微孔板分光光度計上讀取450 nm處的吸光度。集落形成試驗用于細胞增殖測量,將子宮頸癌細胞接種于12孔板中,于37 ℃ 5% CO2下培養。14天后,經4%多聚甲醛固定集落,用結晶紫染色。

1.4 傷口愈合試驗將Hela、SiHa細胞(2.3×105個/孔)置于6孔板中,孵育24 h進行瞬時轉染。6 h后使用無菌200 μL移液管在細胞單層上產生傷口,用含有1% FBS的培養基培養細胞。使用倒置顯微鏡(日本Nikon公司)在0、48 h記錄傷口大小,計算細胞遷移率:遷移率=(1-劃痕面積/初始劃痕面積)×100%,實驗重復3次。

1.5 Transwell檢測將處理的細胞(2×104個/孔)接種在預涂有100 μL Matrigel基質(美國BD公司)的Transwell室(美國Corning公司)中,分別將無血清培養基和完全培養基添加到上室和下室孵育24 h,侵襲的細胞經4%多聚甲醛固定,1%結晶紫染色,鏡下拍照。

1.6 Western blot使用放射免疫沉淀測定緩沖液(上海Beyotime公司)提取細胞總蛋白,采用BCA蛋白定量試劑盒(上海雅酶生物公司)測定蛋白濃度。將蛋白質進行電泳,轉移到聚偏二氟乙烯膜(0.45 μm,美國Merck Millipore公司)。在4 ℃下與0.1%吐溫-20稀釋的一抗孵育過夜:LPCAT1(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶3 000)、vimentin(1 ∶5 000)、N-cadherin(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶5 000)、Slug(1 ∶5 000)、Cyclin D1(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶3 000)。第2天,將膜與適當的二級抗體(美國TransGen Biotech公司)一起孵育。應用超靈敏化學發光(ECL)試劑(美國Millipore公司),捕獲膜上的目標蛋白;用GAPDH作內部對照。

2 結果

2.1 子宮頸癌細胞中LPCAT1的表達與正常子宮頸上皮細胞系HcerEpic相比,LPCAT1在3種子宮頸癌細胞系(SiHa、Hela和CaSki)中表達增加(1.00±0.03vs1.88±0.09、4.25±0.18、2.33±0.13),其中在Hela中的表達最高(圖1)。

圖1 正常子宮頸上皮細胞系HcerEpic和子宮頸癌細胞系(SiHa、Hela和CaSki)中LPCAT1蛋白的表達

2.2 LPCAT1與子宮頸癌細胞體外增殖、遷移和侵襲的關系本組通過shRNA敲低Hela細胞和過表達質粒上調SiHa細胞中LPCAT1的表達(圖2A),結果顯示:與Vector組相比,LPCAT1組SiHa細胞的活力和集落數(92±8vs206±16)顯著增加(P<0.001);與sh-NC組相比,sh-LPCAT1組Hela細胞的活力和集落數(168±10vs58±3)顯著降低(P<0.001,圖2B～D)。此外,與Vector組相比,LPCAT1組SiHa細胞的遷移(56±6vs82±5)和侵襲(79±5vs192±12)細胞數均顯著增加(P<0.01);與sh-NC組相比,sh-LPCAT1組Hela細胞的遷移(79±5vs41±3)和侵襲(125±6vs58±3)細胞數均顯著降低(P<0.01,圖3)。

圖2 A.LPCAT1過表達質粒轉染的SiHa細胞和shRNA轉染的Hela細胞中LPCAT1的表達;B.Vector組和LPCAT1組SiHa細胞的活力;C.sh-LPCAT1組和sh-NC組Hela細胞的活力;D.SiHa細胞和Hela細胞的集落數分析;與Vector組或sh-NC組相比：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

圖3 A.劃痕試驗分析Vector組和LPCAT1組SiHa細胞的轉移能力;B.劃痕試驗分析sh-LPCAT1組和sh-NC組Hela細胞的轉移能力;C、D.Transwell實驗測量SiHa細胞和Hela細胞的侵襲能力：與Vector組或sh-NC組相比,**P<0.01,***P<0.001

2.3 LPCAT1與子宮頸癌細胞EMT的關系本組結果顯示:與Vector組相比,LPCAT1組SiHa細胞中E-cadherin(0.66±0.06vs0.28±0.03)的表達顯著降低(P<0.01),N-cadherin(0.32±0.02vs0.88±0.07)和vimentin(0.35±0.02vs0.81±0.06)的表達顯著增加(P<0.01);與sh-NC組相比,sh-LPCAT1組Hela細胞中E-cadherin(0.20±0.03vs0.72±0.09)的表達顯著增加(P<0.01),N-cadherin(0.68±0.05vs0.22±0.02)和vimentin(0.61±0.04vs0.24±0.02)的表達顯著降低(P<0.01,圖4)。這些結果表明,LPCAT1可能通過EMT增強子宮頸癌細胞的遷移和侵襲。

圖4 敲低LPCAT1與子宮頸癌細胞EMT的關系：與Vector組或sh-NC組相比,**P<0.01,***P<0.001

2.4 β-catenin/Slug信號通路對LPCAT1調節子宮頸癌細胞增殖、遷移和EMT的影響本組結果顯示:與Vector組相比,LPCAT1組SiHa細胞的Wnt4(0.78±0.07vs1.22±0.09)、β-catenin(0.68±0.05vs1.05±0.08)、Slug(0.70±0.07vs1.13±0.06)和Cyclin D1(0.65±0.06vs0.99±0.06)蛋白水平顯著升高(P<0.05);與sh-NC組相比,sh-LPCAT1組Hela細胞的Wnt4(0.72±0.05vs0.33±0.03)、β-catenin(0.60±0.05vs0.25±0.02)、Slug(0.75±0.07vs0.18±0.01)和Cyclin D1(0.83±0.06vs0.20±0.02)蛋白水平顯著降低(P<0.01,圖5A)。為了進一步證實LPCAT1通過激活β-catenin/Slug途徑誘導EMT的發生,本組用β-catenin/Slug信號特異性抑制劑FH535處理LPCAT1過表達的SiHa細胞。與LPCAT1組相比,LPCAT1+FH535組SiHa細胞中Wnt4(1.18±0.05vs0.80±0.06)、β-catenin(1.05±0.08vs0.77±0.05)、Slug(1.13±0.06vs0.28±0.02)、Cyclin D1(0.99±0.06vs0.44±0.02)、N-cadherin(0.91±0.07vs0.46±0.03)和vimentin(0.95±0.06vs0.49±0.03)水平顯著降低(P<0.05),E-cadherin(0.44±0.03vs0.58±0.03)水平顯著增加(P<0.05,圖5B)。此外,與LPCAT1組相比,LPCAT1+FH535組SiHa細胞的集落數(224±15vs146±11)、遷移(85±3vs51±4)和侵襲(166±10vs90±5)細胞數均顯著降低(P<0.05,圖6)。這些結果表明LPCAT1的上調激活了β-catenin/Slug通路,促進了子宮頸癌細胞的EMT和轉移。

圖5 A.Western blot分析SiHa和Hela細胞中β-catenin/Slug信號通路相關蛋白表達：與Vector組或sh-NC組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;B.Western blot分析對照組、LPCAT1組、LPCAT1+FH535組、FH535組SiHa細胞β-catenin/Slug信號通路和EMT相關蛋白表達:與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與LPCAT1組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001

圖6 A.對照組、LPCAT1組、LPCAT1+FH535組、FH535組SiHa細胞的集落數分析;B.Transwell實驗測量對照組、LPCAT1組、LPCAT1+FH535組、FH535組SiHa細胞的侵襲能力;C.劃痕試驗分析對照組、LPCAT1組、LPCAT1+FH535組、FH535組SiHa細胞的轉移能力;與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與LPCAT1組相比,#P<0.05,##P<0.01

3 討論

LPCAT1是參與肝細胞癌、肺腺癌和乳腺癌等腫瘤生長的關鍵分子,涉及調節細胞增殖、細胞死亡和EMT過程[9]。LPCAT1作為子宮頸癌早期診斷的生物學標志物,推測與不良預后有關,但其作用機制尚未完全闡明[8]。本組在子宮頸癌細胞系中證實LPCAT1表達顯著升高,通過shRNAs敲低LPCAT1可抑制子宮頸癌細胞的增殖。此外,子宮頸癌細胞的遷移和侵襲性也被敲低LPCAT1高度抑制,LPCAT1的靶向治療可能提高子宮頸癌患者的預后。

近年,隨著醫療水平不斷提高延長了腫瘤患者的生存時間,但晚期子宮頸癌仍是最具侵襲性的惡性腫瘤[10]。LPCAT1是參與磷脂酰膽堿代謝的關鍵酶,可以控制質膜的磷脂組成,通過介導飽和磷脂酰膽堿影響細胞呼吸[11]。越來越多的研究表明,LPCAT1在多種不同類型腫瘤的啟動和進展中起重要調節作用[12-14]。本組分別在Hela和SiHa細胞中敲低或過表達LPCAT1后行CCK-8、集落形成、細胞劃痕和Transwell檢測,結果表明:敲低和過表達LPCAT1分別降低和增強子宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力,提示LPCAT1在促進子宮頸癌轉移中起重要作用。

腫瘤患者(>90%)死亡的主要原因是癌細胞轉移,EMT對轉移至關重要。當EMT被激活時,癌細胞可以在轉移級聯中遷移并滲透到周圍組織[15]。最近研究報道,LPCAT1通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進肝細胞癌發生EMT[16]。本組假設LPCAT1也通過調節子宮頸癌中的EMT促進細胞轉移,Western blot分析表明,子宮頸癌細胞中過表達LPCAT1可顯著增加N-cadherin和vimentin的表達,同時降低E-cadherin的表達;而在子宮頸癌細胞中敲低LPCAT1后觀察到相反的效果。本組結果表明,異常升高的LPCAT1作為EMT誘導劑,可能通過激活EMT促進子宮頸癌轉移。

β-catenin/Slug信號軸的失調導致子宮頸腫瘤轉移,據文獻報道β-catenin突變發生在HPV(13%～41%)誘發的子宮頸癌患者中[17]。Slug是在正常或惡性細胞中啟動EMT的關鍵調節劑,參與胚胎發育和促進癌細胞的遠處轉移。研究顯示,Slug在啟動子宮頸癌細胞EMT和促進細胞運動性發揮積極作用。當子宮頸癌細胞中的EpCAM和Nrf2減少Slug時,E-cadherin表達顯著增加[18-19],進一步抑制EMT,降低細胞的遷移和侵襲能力。相反,子宮頸癌中的SNHG12可以刺激Slug表達,降低E-cadherin的表達,促進EMT,增強細胞的遠處轉移能力[20]。本組Western blot分析表明,在子宮頸癌細胞中敲低或過表達LPCAT1,分別導致Wnt4、β-catenin、Slug和Cyclin D1的表達下調或上調。此外,LPCAT1過表達部分逆轉FH535抑制β-catenin/Slug通路,對子宮頸癌細胞增殖和EMT的影響。因此,LPCAT1可能通過β-catenin/Slug途徑促進子宮頸癌細胞的增殖、轉移和EMT。

綜上所述,LPCAT1表達升高可能是通過激活β-catenin/Slug信號通路來促進子宮頸癌的轉移和進展,因此LPCAT1有望成為子宮頸癌轉移的潛在生物學標志物。