WHO(2020)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分子分型在子宮內(nèi)膜癌中的應(yīng)用與臨床意義

曹立宇,田壯壯,祝利利,白真真,張 聰

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma, EC)是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,根據(jù)2023年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,EC的發(fā)病率和病死率分別占女性惡性腫瘤的7%和5%[1]。近年我國(guó)女性EC的發(fā)病率與病死率均呈上升趨勢(shì),嚴(yán)重影響女性健康。WHO(2014)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)依據(jù)組織學(xué)特征和免疫表型將EC分為2型:Ⅰ型為低級(jí)別、激素受體依賴(lài)型,臨床惰性;Ⅱ型為非激素受體依賴(lài)型,常伴p53基因突變,有更強(qiáng)的侵襲性。兩者的部分患者臨床特征、形態(tài)學(xué)和免疫表型均有重疊,不能充分反映腫瘤的生物學(xué)行為和判斷患者的預(yù)后。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,2013年美國(guó)癌癥基因圖譜(the Cancer Genoms Atlas, TCGA)應(yīng)用微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和測(cè)序法檢測(cè)POLE基因突變,將EC分為4種分子亞型[2]:POLE突變型、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(高突變)、低拷貝型(子宮內(nèi)膜樣)和高拷貝型(漿液樣)。該分子分型能更好地反映腫瘤的生物學(xué)行為和判斷預(yù)后,具有較好的重復(fù)性和可行性,但該分子分型檢測(cè)費(fèi)用昂貴,難以推廣。有研究發(fā)現(xiàn),采用免疫組化染色和測(cè)序法檢測(cè)將EC分為POLE突變型、錯(cuò)配修復(fù)缺陷型(mismatch repair deficient, MMRd)、無(wú)特異性分子譜型(no specific molecular profile, NMSP)和p53突變型,該分型檢測(cè)費(fèi)用低,易于臨床推廣[3-4]。WHO(2020)女性生殖腫瘤分類(lèi)中采用該分子分型[5],目前國(guó)內(nèi)對(duì)EC該分子分型的研究尚處于起步階段。本文回顧性分析POLE基因突變,探討4種分子分型在EC中的應(yīng)用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年10月～2023年9月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽(yáng)醫(yī)院病理科手術(shù)切除62例EC標(biāo)本。患者均為子宮內(nèi)膜樣癌,年齡39～74歲,平均56.8歲;其中,年齡≤60歲者20例,>60歲者42例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,分別行HE、免疫組化EnVision法染色。另切取5 μm厚石蠟切片5～10張,脫蠟至水后刮取腫瘤組織,常規(guī)提取、純化DNA后行POLE基因突變檢測(cè)。患者術(shù)前均未行放、化療和免疫治療,臨床病理資料完整。一抗MLHl(ES05)、MSH2(MX061)、MSH6(MX056)、PMS2(EP51)、ER(EP51)、PR(EP51)、Ki67(EP51)和p53(MX008),均購(gòu)自福州邁新公司。二抗和免疫組化試劑盒購(gòu)自上海羅氏公司,Benchmark Ventana全自動(dòng)免疫組化染色,陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照,用已知陽(yáng)性切片或腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。MLHl、MSH2、MSH6和PMS2無(wú)腫瘤細(xì)胞染色判讀為表達(dá)缺失,有1個(gè)或以上蛋白表達(dá)缺失則為MMRd型,無(wú)表達(dá)缺失則為錯(cuò)配修復(fù)正常[6-7]。p53陽(yáng)性定位于細(xì)胞核,>80%的腫瘤細(xì)胞核染色或完全失表達(dá)則判為p53蛋白異常表達(dá),否則判為野生型表達(dá),p53免疫組化染色可準(zhǔn)確反映p53基因突變[8]。

1.2.2熒光PCR檢測(cè) POLE基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京閱微基因公司,根據(jù)待測(cè)樣本DNA濃度確定加入基因組DNA數(shù)量,PCR擴(kuò)增體系為20 μL,擴(kuò)增32個(gè)循環(huán),具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。按WHO(2020)女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤分類(lèi)中的分子分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合判斷[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,率的差異性用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率計(jì)算法檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征本組62例EC組織學(xué)類(lèi)型均為子宮內(nèi)膜樣癌;組織學(xué)分級(jí):低級(jí)別(Grade I者37例和GradeⅡ者21例)、高級(jí)別(Grade Ⅲ者4例);無(wú)肌層浸潤(rùn)或浸潤(rùn)深度<1/2子宮肌層者51例,浸潤(rùn)深度≥1/2子宮肌層者11例。62例EC中有38例未行盆腔淋巴結(jié)清掃,無(wú)法評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;24例患者行子宮+附件切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),其中3例有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;脈管侵犯9例,無(wú)明確脈管侵犯53例。按2023年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)EC最新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期:I期50例,Ⅱ期8例,Ⅲ期4例(表1)。

表1 EC分子分型與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 EC分子分型與臨床病理特征的關(guān)系本組62例EC患者,首先采用免疫組化檢測(cè)MMR、p53、ER、PR和Ki67等表達(dá),其次用PCR法檢測(cè)POLE基因的突變。結(jié)果顯示:POLE基因突變型3例(3/62,4.8%),MMRd型15例(15/62,24.2%),NMSP型36例(36/62,58.1%),p53突變型8例(8/62,12.9%)。3例POLE基因突變均在第14號(hào)外顯子,堿基變化為c.1366G>C,氨基酸變化為p.A456P(圖1),其屬于POLE基因上的致病性變異(PMID:31829442),可能導(dǎo)致POLE核酸外切酶失活。3例患者組織學(xué)分級(jí)均為低級(jí)別,FIGO分期均為I期;MMRd型患者15例(15/62,24.2%),其中MSH2表達(dá)缺失5例,PSM2表達(dá)缺失4例,MSH6表達(dá)缺失2例,MLH1表達(dá)缺失1例,MSH2和MSH6共同表達(dá)缺失2例,MLH1和PSM2共同表達(dá)缺失1例(圖2)。15例MMRd型患者中,有1例可見(jiàn)p53蛋白過(guò)表達(dá),2例完全失表達(dá);組織學(xué)分級(jí)中,Grade I級(jí)7例,Grade Ⅱ級(jí)7例,Grade Ⅲ級(jí)1例;FIGO分期I期11例,Ⅱ～Ⅲ期4例,可見(jiàn)2例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。NMSP型36例(36/62,58.1%)組織學(xué)分級(jí)均為低級(jí)別(P<0.05),與其它臨床病理特征均無(wú)關(guān)(P>0.05),FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期,未見(jiàn)組織學(xué)Ⅲ級(jí)和FIGO Ⅲ期患者。p53突變型8例(8/62,12.9%),其中>80%的腫瘤細(xì)胞核染色3例,p53蛋白完全失表達(dá)5例,8例p53異常表達(dá)患者中,病理組織學(xué)Grade I級(jí)2例、Grade Ⅱ級(jí)3例和Grade Ⅲ級(jí)3例,p53突變型與組織學(xué)高級(jí)別(Grade Ⅲ級(jí))有關(guān)(P<

圖1 A.正常組織對(duì)照,未見(jiàn)POLE基因突變,B.POLE基因第14外顯子突變(箭頭),堿基變化為c.1366G>C,氨基酸變化為p.A456P(PMID:31829442)

ABCD

0.05,圖3、4);浸潤(rùn)深度≥1/2子宮肌層者2例,可見(jiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1例,FIGO分期為I期4例,Ⅱ期3例,Ⅲ期1例,其組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期的幾率高于其它分子分型組(表1)。另見(jiàn)1例p53蛋白過(guò)表達(dá)和2例完全失表達(dá)患者同時(shí)伴MMRd,按WHO(2020)女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤分子分型方案歸入MMRd型。

③A③B③C③D③E③F④A④B④C④D④E④F

3 討論

2013年美國(guó)TCGA對(duì)EC進(jìn)行分子分型,該分型為判斷患者預(yù)后和臨床治療提供重要參考。WHO(2020)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)采用該分子分型,并優(yōu)化了檢測(cè)方法[5]。2021年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)推薦其在臨床中應(yīng)用[9],2021年中國(guó)專(zhuān)家組制定《子宮內(nèi)膜癌分子檢測(cè)中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)(2021)》[10]。本組收集62例EC患者標(biāo)本,在已進(jìn)行免疫組化檢測(cè)MMR、p53蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上檢測(cè)POLE基因突變,探討EC的臨床病理特征和4種分子分型在EC中的臨床意義,結(jié)果顯示EC患者多見(jiàn)于中老年人,平均年齡56.8歲,組織學(xué)均為子宮內(nèi)膜樣癌,以低級(jí)別子宮內(nèi)膜樣癌多見(jiàn);浸潤(rùn)深度≥1/2子宮肌層者較少,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低,FIGO分期多為Ⅰ～Ⅱ期,腫瘤增殖指數(shù)低,多為雌激素依賴(lài)性腫瘤,提示多數(shù)患者預(yù)后良好,與文獻(xiàn)報(bào)道EC臨床病理特征一致[3-5]。WHO(2020)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)中POLE基因突變率約為12%[5],Eggink等[11]報(bào)道EC中POLE基因突變發(fā)生率7%～12%,且POLE突變?cè)贗期高級(jí)別癌癥患者中多見(jiàn)。本組62例EC患者中,根據(jù)免疫組化和PCR檢測(cè)顯示:POLE基因突變型3例、MMRd型15例、NMSP型36例和p53異常表達(dá)型8例,分別占4.8%(3/62)、24.2%(15/62)、58.1%(36/62)和12.9%(8/62)。POLE突變率和p53異常陽(yáng)性率略低于文獻(xiàn)報(bào)道,可能與樣本量低和PCR法不能完全檢測(cè)到POLE基因突變有關(guān),需進(jìn)一步行二代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)驗(yàn)證。分析不同分子亞型與臨床病理特征關(guān)系發(fā)現(xiàn),3例POLE基因突變患者均為子宮內(nèi)膜樣癌,2例為WHO Ⅱ級(jí)、1例為WHO I級(jí),均未見(jiàn)脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,FIGO分期為I期,提示患者組織學(xué)有一定異型性,臨床分期一般較早,患者可能預(yù)后較好,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。POLE突變型EC患者預(yù)后較好可能與腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden, TMB)較高有關(guān)[12],基因突變刺激機(jī)體產(chǎn)生大量腫瘤新生抗原,誘發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。本組3例患者病理組織學(xué)在癌組織周?chē)梢?jiàn)較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),可能與該機(jī)制有關(guān)。鑒于本組病例數(shù)較少,需擴(kuò)大樣本量檢測(cè)并進(jìn)一步隨訪證實(shí)。

微衛(wèi)星是基因組中的一類(lèi)短串聯(lián)重復(fù)DNA序列,一般由1～6個(gè)核苷酸組成,其穩(wěn)定性依賴(lài)于MMR進(jìn)行修復(fù),包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2,如≥1個(gè)蛋白表達(dá)缺失導(dǎo)致MMRd型或微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。評(píng)估MMR狀態(tài)對(duì)臨床免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用至關(guān)重要,傳統(tǒng)的PCR(即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性PCR)是確認(rèn)MMR狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)。Amemiya等[13]應(yīng)用免疫組化檢測(cè)14種腫瘤類(lèi)型284例患者的319個(gè)樣本中MMR狀態(tài),與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性PCR檢測(cè)符合率為98.1%(313/319),提示單獨(dú)采用免疫組化檢測(cè)可評(píng)估MMR的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)具有MMRd型的EC常伴不良預(yù)后因素,如組織學(xué)分級(jí)較高、脈管侵犯等[14]。25%～30%的EC患者為該亞型,免疫檢查點(diǎn)抑制劑可改善MMRd型患者的抗腫瘤免疫反應(yīng),提高患者臨床治療效果[2]。本組62例EC中免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)15例為MMRd型,約占24.2%(15/62),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15],其中MSH2、PSM2、MSH6和MLH1蛋白單獨(dú)表達(dá)缺失分別為5、4、2和1例,另見(jiàn)2例MSH2/MSH6共同表達(dá)缺失和1例MLH1/PSM2共同表達(dá)缺失。15例MMRd型患者病理組織學(xué)分級(jí)中,Grade Ⅰ級(jí)7例,GradeⅡ級(jí)7例,Grade Ⅲ級(jí)1例;浸潤(rùn)深度≥1/2肌層和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增高,提示與POLE突變型相比,MMRd型患者可能預(yù)后相對(duì)較差。部分EC患者同時(shí)具有POLE突變型與其它基因突變類(lèi)型,如POLE突變/MMRd或MMRd/p53突變[16]。本組15例MMR缺失表達(dá)患者中,可見(jiàn)3例p53異常表達(dá),可能與MMR缺失的EC患者繼發(fā)p53基因突變有關(guān),應(yīng)歸入MMRd亞型[16]。

研究發(fā)現(xiàn):EC的4種分子分型中,p53異常型多為POLE野生型、MMR正常,臨床需行放、化療,預(yù)后較差,50%～70%的EC患者死亡與p53異常表達(dá)有關(guān)。p53異常在漿液性EC中的比例約為93%,在癌肉瘤中約85%,在透明細(xì)胞EC中約38%,在高級(jí)別(Grade Ⅲ級(jí))子宮內(nèi)膜樣EC中約為22%,而在低級(jí)別(Grade I和Ⅱ級(jí))子宮內(nèi)膜樣EC中僅為5%[17],提示p53異常是判斷EC預(yù)后的指標(biāo)。Vermij等[18]發(fā)現(xiàn)p53行免疫組化染色與NGS檢測(cè)一致性為90.7% (95%CI:87.6%～93.8%),敏感性為83.6%(95%CI:79.7%～87.5%),特異性為94.3% (95%CI: 91.8%～96.7%),提示p53免疫組化染色異常可代替p53基因突變檢測(cè),在子宮內(nèi)膜活檢標(biāo)本中亦達(dá)到有效驗(yàn)證[8]。本組62例EC中,p53異常表達(dá)8例,發(fā)生率約12.9%(8/62)。p53異常表達(dá)與組織學(xué)高級(jí)別有關(guān)(P<0.05),Ki67增殖指數(shù)較高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高、FIGO分期晚提示患者預(yù)后較差,可能是由于p53基因突變導(dǎo)致腫瘤抑制功能減弱,促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移等[19]。本組8例p53突變型患者中有3例p53蛋白過(guò)表達(dá),提示p53基因發(fā)生錯(cuò)義突變;5例p53蛋白完全失表達(dá),提示p53基因發(fā)生無(wú)義突變。另見(jiàn)1例p53蛋白過(guò)表達(dá)和2例完全失表達(dá)患者同時(shí)伴錯(cuò)配修復(fù)缺陷,按WHO分子分型歸為MMRd型。本組顯示NSMP型36例(58.1%,36/62),略高于文獻(xiàn)報(bào)道,可能與POLE基因突變檢出率和p53蛋白異常表達(dá)檢出率較低有關(guān)。該組患者均為低級(jí)別,NSMP型與組織學(xué)低級(jí)別有關(guān)(P<0.05)。NSMP型患者腫瘤浸潤(rùn)深度較淺,常無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,FIGO分期較早,提示該組患者預(yù)后相對(duì)較好。文獻(xiàn)報(bào)道,NSMP型患者與MMRd型相比,預(yù)后無(wú)明顯差異[20]。

總之,WHO(2020)女性生殖系統(tǒng)腫瘤的分子分型對(duì)EC患者治療和預(yù)后有重要意義。部分EC患者有多重分子表型,如POLE基因突變型和MMRd型可繼發(fā)p53基因突變,僅采用免疫組化檢測(cè)p53蛋白可能會(huì)因異常表達(dá)而誤判為p53異常型EC。雖然免疫組化檢測(cè)p53和MMR蛋白表達(dá)與基因檢測(cè)一致性高,但仍有少部分病例不一致導(dǎo)致錯(cuò)誤的分子分型。本實(shí)驗(yàn)病例數(shù)較少,還需積累更多樣本以進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。