CD147通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控脂肪酸合成對(duì)子宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

李金秋,尚香玉,嚴(yán)怡然,艾麗努爾·艾尼,阿仙姑·哈斯木

子宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤,僅次于乳腺癌。新疆是子宮頸癌高發(fā)地區(qū),發(fā)病率與病死率趨于年輕化[1]。HPV持續(xù)感染是引起子宮頸癌的主要原因,轉(zhuǎn)移是子宮頸癌復(fù)發(fā)和治療失敗的重要因素。近年,脂質(zhì)代謝異常被認(rèn)為是癌細(xì)胞的標(biāo)志物[2];與利用外源性脂肪酸的正常細(xì)胞相比,多數(shù)癌細(xì)胞表現(xiàn)為較強(qiáng)的內(nèi)源性脂肪酸合成[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),子宮頸癌細(xì)胞中脂滴的蓄積促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖、侵襲和遷移能力[4]。CD147屬于跨膜糖蛋白,在多種惡性細(xì)胞表面高表達(dá)[5],對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成起重要作用。CD147作為細(xì)胞黏附分子,誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶分泌的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用[6-7]。研究表明,CD147激活p53通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞糖代謝重編程[8]。目前,CD147與子宮頸癌脂質(zhì)代謝異常關(guān)系的分子機(jī)制尚不明確。本文旨在探索CD147異常表達(dá)對(duì)子宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響和調(diào)控脂質(zhì)代謝的關(guān)系,為患者預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料子宮頸癌細(xì)胞Siha、Hela和正常子宮頸上皮細(xì)胞H8,均購(gòu)自武漢普諾賽公司;慢病毒由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。一抗CD147、ACC1、E-cadherin、N-cadherin和β-actin均購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司;Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Boehringer Ingelheim公司;BODIPY試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司;Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(https://xenabrowser.net/)中下載經(jīng)統(tǒng)一的泛癌數(shù)據(jù)集:TCGA TARGET GTEx(PANCAN,n=19 131,G=60 499),提取ENSG00000172270(BSG)基因在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌和腺癌中的表達(dá),對(duì)每一個(gè)表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2(x+0.001)變換,獲得該基因在子宮頸癌中的表達(dá)。采用R軟件maxstat計(jì)算BSG的最佳截?cái)嘀?設(shè)置最小分組樣本數(shù)>25%,最大樣本數(shù)分組<75%,最佳截?cái)嘀禐?.904 5,將其分為高、低表達(dá)組。應(yīng)用R軟件Survival函數(shù)分析兩組的預(yù)后差異,利用Kaplan-Meier法評(píng)估不同樣本間的預(yù)后差異。使用R軟件計(jì)算不同臨床分期中的基因表達(dá)差異。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 子宮頸癌Siha、Hela細(xì)胞系與正常子宮頸上皮H8細(xì)胞系,使用DMEM完全培養(yǎng)基,包含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3慢病毒轉(zhuǎn)染和分組 CD147慢病毒(sh-CD147)和對(duì)照空載體慢病毒(NC-CD147),由上海吉?jiǎng)P基因構(gòu)建。根據(jù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,制成每毫升(5～6)×104個(gè)細(xì)胞懸液,分別吸取1 mL細(xì)胞懸液置于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞量達(dá)20%～40%時(shí),棄完全培養(yǎng)基用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)。24 h后棄無(wú)血清培養(yǎng)基,采用含血清培養(yǎng)基加入sh-CD147慢病毒和NC-CD147,轉(zhuǎn)染72 h。當(dāng)細(xì)胞量達(dá)90%時(shí),用1 μg/mL嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的子宮頸癌Hela細(xì)胞,篩選5～7天,將存活細(xì)胞用0.5 μg/mL嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4Western blot法 將細(xì)胞沉淀于細(xì)胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物中裂解30 min,提取的蛋白樣品在10%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。抗體稀釋:CD147 (1 ∶6 000)、Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(1 ∶1 500)、E-cadherin(1 ∶5 000)、E-cadherin(1 ∶4 500)和β-actin(1 ∶10 000)。使用10%脫脂牛奶進(jìn)行常溫封閉1.5 h,一抗室溫孵育100 min,二抗(稀釋比1 ∶10 000)室溫避光孵育1 h,應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影。

1.2.5BODIPY脂質(zhì)染色 每組以每毫升1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于3.5 cm激光共聚焦培養(yǎng)皿中,細(xì)胞貼壁后去除細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS沖洗細(xì)胞3次。經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min,PBS沖洗3次,與BODIPY試劑避光孵育20 min,PBS清洗3次。添加DAPI染液至小皿中繼續(xù)避光孵育5 min,PBS清洗3次,置于激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.6脂肪酸含量檢測(cè) 每組細(xì)胞以每毫升1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后更換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,于孵育箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞上清液,采用試劑盒檢測(cè)上清液中脂肪酸含量。

1.2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲與遷移能力 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)步驟:上室垂直加入60 μL的8～12 mg/mL的Matrigel(使用前需與無(wú)血清培養(yǎng)基以1 ∶8稀釋),培養(yǎng)箱中放置3 h,使Matrigel聚合成膜,吸棄上室多余液體,隨后向上室中加入5×104個(gè)細(xì)胞/ 200 μL的無(wú)血清細(xì)胞懸液,下室加入600 μL完全培養(yǎng)基(含血清)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)步驟與上述侵襲實(shí)驗(yàn)步驟相似,但該步驟不需要添加Matrigel膠;24 h后取出24孔板,采用10%中性福爾馬林固定30 min或4 ℃冰箱過(guò)夜,PBS沖洗3次,每次15 min;使用1%結(jié)晶紫工作液室溫染色10～15 min,PBS清洗3次,倒置顯微鏡下觀察上室底面細(xì)胞數(shù)。

1.2.8CCK-8和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖和集落形成能力 本實(shí)驗(yàn)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞制成2 000個(gè)/100μL細(xì)胞懸液,加入96孔板中,每隔24 h取出加入10 μL CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5～4 h。采用450 nm單波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度,利用3.5 cm小皿進(jìn)行克隆形成試驗(yàn),將不同分組的細(xì)胞以1×103個(gè)細(xì)胞/皿進(jìn)行培養(yǎng),7～15天觀察集落大小和數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌組織和細(xì)胞中CD147的表達(dá)利用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)分析BSG基因編碼CD147蛋白在子宮頸癌和正常子宮頸上皮組織中的表達(dá),結(jié)果顯示:與正常子宮頸上皮相比,子宮頸癌中CD147的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01,圖1A)。CD147過(guò)表達(dá)與子宮頸癌臨床Stage分期相關(guān),Ⅳ期CD147表達(dá)最高(P<0.05,圖1B)。采用Kaplan-Meier法評(píng)估不同樣本間的預(yù)后差異,結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)CD147患者生存時(shí)間縮短(P=0.04,圖1C)。本組應(yīng)用Western blot法檢測(cè)CD147在子宮頸癌細(xì)胞Siha、Hela與正常子宮頸上皮H8細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果顯示:與H8細(xì)胞相比,CD147在子宮頸癌Hela細(xì)胞中高表達(dá)(Siha:1.247±0.049 、Hela:1.436±0.122、H8:1.003±0.102,F=10.314,P=0.011,圖2)。

圖1 子宮頸癌組織和細(xì)胞中CD147的表達(dá)：A. UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)分析子宮頸癌和癌旁正常組織中CD147的表達(dá),與正常組織相比,**P<0.01;B.分析CD147表達(dá)與臨床Stage分期的相關(guān)性,*P<0.05;C.Kaplan-Meier法評(píng)估不同樣本間CD147表達(dá)與預(yù)后

圖2 Western blot法檢測(cè)CD147蛋白在子宮頸癌細(xì)胞Siha、Hela和正常子宮頸上皮細(xì)胞H8中的表達(dá),與H8細(xì)胞相比,*P<0.05,**P<0.01

2.2 Western blot法檢測(cè)子宮頸癌細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率CD147載體和對(duì)照空載體慢病毒感染子宮頸癌Hela細(xì)胞系,構(gòu)建sh-CD147組(CD147低表達(dá))與NC-CD147組(空載)。Western blot法驗(yàn)證各組細(xì)胞CD147蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示:在Hela細(xì)胞系sh-CD147 組中CD147的表達(dá)量比NC-CD147組和Hela組低[(0.296±0.089 5)vs(1.025±0.092)vs(1.063±0.096,F=67.604,P<0.001,圖3)]。

圖3 Western blot法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后CD147蛋白表達(dá)：與Hela組相比,***P<0.001

2.3 CD147表達(dá)與子宮頸癌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成的關(guān)系Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,sh-CD147組細(xì)胞中ACC1和FASN蛋白表達(dá)顯著低于Hela組(P<0.001,圖4)。BODIPY染色結(jié)果表明,與Hela組相比,sh-CD147組細(xì)胞內(nèi)FITC-綠色熒光信號(hào)顯著減弱,表明細(xì)胞內(nèi)脂滴含量減少(圖5)。脂肪酸含量試劑盒檢測(cè)sh-CD147組(0.626±0.039)細(xì)胞脂肪酸含量比Hela組(1.029±0.106)顯著下降(P<0.001,圖6),提示下調(diào)CD147抑制脂肪酸合成關(guān)鍵酶表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。

圖4 Western blot法檢測(cè)下調(diào)CD147表達(dá)后各組子宮頸癌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白ACC1和FASN的表達(dá)：與Hela組相比,***P<0.001

圖5 BODIPY染色檢測(cè)下調(diào)CD147表達(dá)后各組子宮頸癌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況:綠色熒光為脂質(zhì)染色,亮藍(lán)色為細(xì)胞核染色

圖6 下調(diào)CD147表達(dá)后檢測(cè)各組子宮頸癌細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量,與Hela組相比,***P<0.001

2.4 CD147表達(dá)與子宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的關(guān)系平板克隆實(shí)驗(yàn)表明:第1周時(shí),sh-CD147組的細(xì)胞克隆數(shù)低于對(duì)照Hela組;在第2周時(shí),兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明,與Hela組相比,72 h時(shí)sh-CD147組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05,圖7)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Hela組相比,sh-CD147組細(xì)胞侵襲和遷移能力降低(圖8),提示下調(diào)CD147表達(dá)可減弱Hela細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:與Hela組相比,sh-CD147組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)增強(qiáng),N-cadherin的表達(dá)降低(圖9)。

圖7 下調(diào)CD147表達(dá)后對(duì)各組子宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響：A.細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn);B.CCK-8實(shí)驗(yàn),與Hela組相比,*P<0.05

圖8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)CD147表達(dá)各組子宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力

圖9 Western blot法檢測(cè)下調(diào)CD147表達(dá)子宮頸癌細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.5 CD147激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控脂肪酸合成關(guān)鍵酶的表達(dá)Western blot法檢測(cè)Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá),與Hela組相比,sh-CD147組細(xì)胞內(nèi)p-Akt和p-mTOR的表達(dá)降低(P<0.01),非磷酸化Akt和mTOR表達(dá)不變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot結(jié)果顯示,與sh-CD147相比,sh-CD147組加入Akt激動(dòng)劑SC-79劑處理后(sh-CD147-SC-79)脂肪酸合成關(guān)鍵酶ACC1和FASN表達(dá)水平顯著被恢復(fù)(P<0.01,圖10)。BODIPY染色和脂肪酸含量檢測(cè)結(jié)果與關(guān)鍵酶表達(dá)一致(P<0.01,圖11)。sh-CD147組加入Akt激動(dòng)劑SC-79劑處理后,細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力顯著增強(qiáng)(圖12)。

圖10 Western blot法檢測(cè)各組子宮頸癌細(xì)胞Akt/mTOR通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)：A.Western blot法檢測(cè)下調(diào)CD147表達(dá)后,Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表達(dá);B.Western blot法檢測(cè)sh-CD147組加入Akt激動(dòng)劑SC-79劑處理后,Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、ACC1、FASN和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平

圖11 BODIPY染色和脂肪酸含量檢測(cè)sh-CD147組加入Akt激動(dòng)劑SC-79劑處理后,各組子宮頸癌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和脂肪酸含量：A.BODIPY染色檢測(cè),綠色熒光為脂質(zhì)染色,亮藍(lán)色為細(xì)胞核染色;B.脂肪酸含量檢測(cè),與sh-CD147組相比,**P<0.01

圖12 細(xì)胞平板克隆和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sh-CD147組加入Akt激動(dòng)劑SC-79劑處理后,各組子宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力:A.細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn);B.Transwell實(shí)驗(yàn)

3 討論

目前,中國(guó)女性子宮頸癌的發(fā)病率持續(xù)上升[9]。子宮頸癌在經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的國(guó)家或地區(qū)呈年輕化趨勢(shì),與該地區(qū)年輕人參與篩查比例增高、首次性行為較早和性伴侶數(shù)量過(guò)多導(dǎo)致HPV暴露增加有關(guān)[10]。子宮頸癌患者預(yù)后不良的主要原因是腫瘤的惡性侵襲和轉(zhuǎn)移,探討子宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)尋找治療靶點(diǎn)具有重要意義。本組證實(shí)子宮頸癌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝受跨膜蛋白CD147的調(diào)控,對(duì)子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展起重要作用。研究表明,CD147通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)通路上調(diào)脂肪酸合成關(guān)鍵酶ACC1和FASN的表達(dá),促進(jìn)內(nèi)源性脂肪酸合成,使腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

腫瘤細(xì)胞內(nèi)約90%的脂肪酸來(lái)自?xún)?nèi)源性從頭合成,部分為外源性攝取。內(nèi)源性合成增強(qiáng)主要涉及脂肪酸合成關(guān)鍵酶的表達(dá)增加,研究顯示許多腫瘤中FASN和ACC1呈過(guò)表達(dá),包括子宮頸癌[11-12]。目前,參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)介質(zhì)如何應(yīng)對(duì)異常的代謝應(yīng)激,并將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的機(jī)制尚不清楚。因此,有學(xué)者分析跨膜蛋白在脂質(zhì)代謝重編程中的作用,Liao等[13]報(bào)道CD147在肺癌中過(guò)表達(dá),與腫瘤患者預(yù)后不良有關(guān)。本組UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)BSG基因在子宮頸癌中高表達(dá),與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本組進(jìn)一步檢測(cè)CD147在子宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)CD147在HPV 18陽(yáng)性的Hela細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較高。

既往研究表明,CD147作為典型的跨膜糖蛋白在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[14-15]。由于脂質(zhì)是腫瘤細(xì)胞膜形成和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)分子中的主要原料,推測(cè)CD147重編程的脂質(zhì)代謝參與子宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本組下調(diào)CD147表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)染色降低、脂肪酸含量減少,抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。Western blot檢測(cè)顯示,EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)升高、N-cadherin表達(dá)降低,提示下調(diào)CD147表達(dá)可抑制子宮頸癌細(xì)胞內(nèi)源性脂肪酸合成,導(dǎo)致惡性生物學(xué)行為減弱,但具體機(jī)制尚不清楚。在腫瘤惡性進(jìn)展中Akt/mTOR是最常見(jiàn)的異常代謝調(diào)節(jié)通路,研究顯示Akt/mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)GLUT1增加葡萄糖攝取,調(diào)節(jié)PPARγ介導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)的重構(gòu)[16-17]。HIF-2上調(diào)激活PI3K-Akt-mTOR通路增加脂質(zhì)合成,促進(jìn)非酒精性脂肪肝發(fā)展為肝細(xì)胞癌[18]。Akt/mTOR作為經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,異常活化導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),CD147通過(guò)PI3K/Akt通路介導(dǎo)葡萄糖代謝,促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的致癌作用[19-21]。因此,本組推測(cè)CD147可能通過(guò)激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)子宮頸癌脂肪酸的合成,促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。Western blot結(jié)果顯示,下調(diào)CD147表達(dá)后降低細(xì)胞中p-Akt(Ser473)和p-mTOR(Ser2448)蛋白表達(dá);加入Akt激動(dòng)劑SC-79后,上述結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。同時(shí),子宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ACC1、FASN表達(dá)增加,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增高,增殖和侵襲遷移能力增強(qiáng)。上述研究結(jié)果顯示,該過(guò)程與異常的Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,CD147在子宮頸癌組織和細(xì)胞中過(guò)表達(dá),下調(diào)CD147表達(dá)抑制Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)脂肪酸合成關(guān)鍵酶低表達(dá),影響子宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。