延胡索酸水合酶與2琥珀酸半胱氨酸在初篩延胡索酸水合酶缺陷型子宮平滑肌瘤的應用價值

方甜甜,施 鳳,錢 寧,張維菊,顧 蕓

遺傳性平滑肌瘤病和腎細胞癌(hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma-associated renal cell carcinoma, HLRCC)綜合征屬于常染色體顯性遺傳性家族性疾病,是由延胡索酸水合酶(fumarate hydratase, FH)胚系基因突變引起的[1]。HLRCC以多發性皮膚和子宮平滑肌瘤為首發表現,即延胡索酸水合酶缺陷型(fumarate hydratase-deficient, FH-d),高達62%的患者發展為侵襲性腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)并于確診5年內死亡[2]。因此,早期準確識別HLRCC的前哨病變—FH-d型平滑肌瘤,對篩查HLRCC患者具有重要意義[3]。奇異核平滑肌瘤(leiomyoma with bizarre nuclei, LBN)是具有非典型細胞核的子宮平滑肌腫瘤[4],包括I和Ⅱ型,其中I型LBN與FH-d型平滑肌瘤形態學有重疊,日常工作中大多數FH-d型平滑肌瘤均被診斷為LBN,這可能貽誤HLRCC患者治療時機。最近,文獻報道FH和2琥珀酸半胱氨酸(2-succinocysteine, 2SC)是LBN與FH-d型平滑肌瘤鑒別診斷的標志物[5]。本文采用免疫組化染色分析FH和2SC的表達,探討兩者在具有奇異核特征平滑肌瘤的初篩FH-d型平滑肌瘤中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2013年1月～2020年12月我院行手術切除的具有奇異核特征平滑肌瘤石蠟標本67例,其中全子宮切除術21例,肌瘤旋切術30例,肌瘤挖除術16例。67例患者中44例因常規體檢發現,其余為盆腔包塊、月經量增多、經期延長和絕經后陰道異常出血等檢查時發現。患者年齡24～68歲,平均39.5歲。肌瘤呈灰白色,部分灰黃、灰紅色,質韌。29例腫瘤單發,33例腫瘤多發(腫瘤數量2～20枚不等),5例腫瘤數量未知。腫瘤最大徑0.7～12 cm,平均5.75 cm。所有患者均否認皮膚平滑肌瘤、腎臟腫瘤病史。

1.2 方法評估腫瘤以下特征:奇異核的細胞密度(低:低于普通型平滑肌瘤的細胞密度;中:接近普通型平滑肌瘤的細胞密度;高:接近富于細胞型平滑肌瘤的細胞密度),細胞分布(局灶、多灶和彌漫),是否存在鹿角形血管,有無嗜酸性包涵體、顯著嗜酸性大核仁和核仁周圍空暈。依據FH-d形態學特征(包括細胞密度高、顯著嗜酸性核仁、核仁周圍空暈、胞質嗜酸性、細胞質纖維絲、鹿角形血管和胞質內嗜酸性包涵體),≥2項則認為具有FH-d形態平滑肌瘤。所有病例均由兩名高級職稱病理醫師采用雙盲法獨立閱片。

1.3 免疫組化采用免疫組化EnVision兩步法染色,一抗FH、2SC和二抗試劑盒均購自北京中杉金橋公司,具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。FH以腫瘤細胞胞質任何程度棕黃色顆粒狀著色為陽性,以血管內皮細胞為陽性內對照。2SC以腫瘤細胞核或胞質彌漫棕黃色顆粒著色為陽性。

1.4 統計學分析采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析。患者年齡和腫瘤最大徑為正態分布計量資料,組間比較采用t檢驗。其余計數資料采用例數和百分數表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗,雙側校驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 臨床病理特征鏡下腫瘤均邊界清楚,無浸潤。奇異核細胞表現為圓形、橢圓形或多邊形等多種怪異形狀,呈多灶或彌漫分布,>1/2腫瘤細胞密度中等,與典型平滑肌瘤以梭形細胞為主不同。奇異核細胞核體積增大,核深染,核型不規則,形狀怪異。部分奇異核細胞表現為顯著的嗜酸性大核仁,核仁周圍空暈(圖1)。36例腫瘤內間質水腫,67例腫瘤胞質呈纖維絲樣(圖2),核分裂象少見,均未見腫瘤性壞死。

①②③④⑤⑥

2.2 免疫表型本組67例中FH陽性33例,陰性34例(圖3);2SC陽性37例(圖4),陰性30例。顯著嗜酸性核仁、核仁周圍空暈、嗜酸性包涵體(圖5)和鹿角形血管(圖6)常見于FH陰性組和2SC陽性組(P<0.05),與腫瘤數量、細胞密度、奇異核分布和間質水腫均無關(P>0.05,表1)。FH和2SC陽性與FH-d形態之間,差異有統計學意義(P<0.05,表2)。

表1 FH和2SC表達與具有奇異核特征平滑肌瘤臨床病理特征的關系[n(%)]

表2 具有奇異核特征平滑肌瘤中FH和2SC的表達[n(%)]

2.3 FH和2SC表達的相關性67例腫瘤中有30例FH陽性、2SC陰性,34例FH陰性、2SC陽性,3例FH和2SC均陽性。Fisher確切概率法顯示,FH與2SC的表達存在相關性(P<0.001)。

2.4 隨訪67例患者中有65例獲得隨訪,時間2～116個月,中位數34個月。截至2022年10月31日,患者均存活。本組6例(8.95%)B超示復發,其中4例診斷為具有FH-d形態平滑肌瘤,且FH陰性、2SC陽性;2例為無FH-d形態平滑肌瘤,其FH陽性、2SC陰性。在27例具有FH-d形態平滑肌瘤組中,2例(FH均陰性、2SC均陽性)進行外周血樣本DNA檢測,1例未檢測出已知致病變異,另1例患者檢測到胚系FH基因疑似致病變異(FH c.1109-2A>c)。

3 討論

HLRCC是由FH基因雜合突變引起的,發病機制有待進一步探索。HLRCC臨床表現為多發性皮膚平滑肌瘤、子宮平滑肌瘤和RCC。其特點是侵襲性腎癌風險增加,該腎癌通常為2型乳頭狀RCC,且多數受累女性均表現為子宮肌瘤。患者確診子宮肌瘤的中位年齡30歲,早于RCC(46歲)和普通型子宮平滑肌瘤(38歲)。研究認為,FH-d型平滑肌瘤是HLRCC的前哨病變。

LBN是良性平滑肌細胞腫瘤,約占子宮平滑肌源性腫瘤的1%[6],好發于中年女性,臨床表現與普通型子宮平滑肌瘤無明顯區別。LBN依據核形態分為:Ⅰ型LBN細胞核圓形或橢圓形,核膜清楚光滑,核仁突出,核仁周圍可見空暈,染色質粗糙開放,奇異核細胞多彌漫性分布;Ⅱ型LBN細胞核長桿狀或紡錘形,核膜不規則,核仁不明顯或無核仁,染色質深染[7]。由于I型LBN與FH-d型平滑肌瘤組織學有重疊,導致絕大多數FH-d型平滑肌瘤被單純診斷為LBN。因此,從具有奇異核特征平滑肌瘤中檢測出FH-d型平滑肌瘤,識別早期HLRCC,將為HLRCC患者和直系親屬提供早發現、早治療的機會。

FH基因位于染色體1q42.3上,在三羧酸循環中催化延胡索酸轉化為L-蘋果酸。FH基因突變存在多種類型,包括錯義突變、移碼突變和無義突變等[8],以錯義突變最常見。FH基因活性的喪失引起延胡索酸積累,積聚的延胡索酸與不同蛋白上的半胱氨酸殘基結合形成產物2SC[9]。FH酶活性的喪失主要表現:FH陰性、2SC陽性。本組FH-d型平滑肌瘤中FH敏感度為92.59%(25/27),特異度77.50%(31/40);2SC敏感度為96.30%(26/27),特異度為72.50%(29/40)。Joseph等[1]發現2SC陽性時提示FH基因發生突變,FH缺失特異性較高,但敏感度較低。由于穩定、無功能的蛋白產物可出現免疫組化表達[10],因此FH基因錯義突變時其免疫標記也可能為陽性,FH陽性并不能排除HLRCC,單一利用FH免疫組化篩查FH-d型平滑肌瘤可能會出現遺漏。FH和2SC存在多種表達模式,本組有3例FH+、2SC+,30例FH+、2SC-,34例FH-、2SC+。3例FH+、2SC+均無FH-d形態,30例FH+、2SC-中僅1例(1/30,3.33%)具有FH-d形態,34例FH-、2SC+中25例(25/34,73.53%)具有FH-d形態,研究證實FH和2SC的免疫組化表達存在相關性。FH和2SC的表達與顯著嗜酸性核仁、核仁周圍空暈、嗜酸性包涵體和鹿角形血管均有關[11]。

免疫組化屬于蛋白水平檢測,FH缺失無法判斷FH基因是胚系突變或體系突變。目前,分子遺傳學檢測是HLRCC綜合征診斷的唯一方法。本組的不足之處在于只有2例具有FH-d形態的平滑肌瘤患者進行外周血DNA檢測,1例存在FH胚系突變,對于FH和2SC均陽性的患者缺乏分子檢測。

綜上所述,LBN與FH-d型平滑肌瘤有形態學交叉,具有明顯嗜酸性核仁、核仁周圍空暈、胞質內嗜酸性包涵體和鹿角形血管的LBN應警惕FH-d型平滑肌瘤。FH和2SC在具有奇異核特征平滑肌瘤中識別FH-d型平滑肌瘤具有較高的敏感度和特異度,且兩者表達有相關性。建議病理醫師對FH-、2SC+和FH+、2SC+的LBN患者進行遺傳咨詢和基因檢測,以早期識別HLRCC綜合征。