微衛星不穩定性(MSI)檢測技術專家共識

中國醫師協會醫學技師委員會病理技術專家組,中國醫學裝備協會病理裝備分會標準化部,中國研究型醫院學會病理學專業委員會病理技術學組,中國抗癌協會腫瘤病理專業委員會病理技術學組

微衛星不穩定性(microsatellite instability, MSI)是DNA復制過程中形成大量移碼突變、引起的核苷酸重復單元數量改變的現象,多種腫瘤中均可見MSI,常見于結直腸癌、子宮內膜癌和胃癌。MSI檢測對多種實體瘤患者有重要意義,包括林奇綜合征篩查、指導5-FU類化療藥物的選擇、預后分層和篩選免疫檢查點抑制劑獲益人群等。目前,MSI檢測主要包括PCR+毛細管電泳法、PCR+高分辨率熔解曲線法和NGS法,其中以PCR+毛細管電泳法為金標準。本文基于3種常用的技術平臺并結合臨床工作經驗,對MSI相關機制、檢測方法和質量控制等進行闡述,以進一步指導與規范我國MSI的檢測工作。

1 MSI的概念

微衛星是存在于原核生物和真核生物的基因組中,通常由1～6個堿基對組成的DNA串聯重復序列,其又被稱作簡單重復序列或短串聯重復序列[1-2],常見類型包括單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復或四核苷酸重復等。微衛星的多態性主要由核心區重復序列的拷貝數差異引起,在一類重復序列中1個特定序列重復的豐度可能有較大差異,如在單核苷酸重復的情況下,poly(A)或poly(T)的密度比poly(G)或poly(C)的密度大300倍。在二核苷酸重復序列中,AC和AT較多,CG最少。由于DNA錯配修復(mismatch repair, MMR)基因的突變或表觀遺傳發生變化,DNA MMR系統的正常功能被破壞、微衛星堿基對數量發生改變稱為MSI。微衛星作為重要的序列組成部分,在基因組調控中發揮多種作用[3-4]。微衛星DNA多樣性,是構成人類基因組多樣性的分子機制之一。

2 MSI的發展史

1984年,英國萊斯特大學發現人類肌紅蛋白基因中存在多態GGAT重復序列。1989年,由Litt和Luty首次提出“微衛星”的概念[5](圖1)。微衛星是短而重復的DNA序列,具有分布廣泛、非隨機的特點,約占人類基因組的3%,主要分布在基因的非編碼區和染色體末端[3]。在真核生物中,高保真的DNA復制對維持細胞基因組穩定性和正常生理功能至關重要,但基因復制過程中受環境因素等影響,易發生核苷酸的錯誤摻入或缺失,引起基因組中重復序列次數的增加或丟失。在DNA聚合酶和多種修復機制的基礎上,一般情況下DNA復制的錯誤會被修復。然而,當作為高保真DNA復制最后一道防線的MMR系統出現啟動子超甲基化或基因突變時,DNA復制錯誤無法糾正并連續積累,微衛星的序列長度或堿基組成發生變化稱為MSI,使基因組表現高突變表型[6]。

圖1 MSI發展歷史中的代表性事件

1993年,研究者發現在遺傳性非息肉病結直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC)中MSI的發生率高達86%,而在散發性結直腸癌中MSI的發生率也達16%[7]。與此同時,陸續有研究者在結直腸癌中發現類似分子現象,與MMR系統功能缺陷密切相關,影響結直腸癌患者的生存時間[8]。1997年,美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute, NCI)在結直腸癌的國際專題會議上,對MSI進行統一定義,即與正常組織相比,腫瘤組織中由微衛星重復單元的插入或缺失導致的微衛星長度改變稱為MSI。同年,美國NCI在MSI研討會對MSI檢測位點的選擇和診斷標準進行規范和統一,推薦了簡稱為“2B3D”的MSI位點檢測Panel,稱之為Bethesda Panel或NCI Panel,該Panel包括2個單核苷酸位點(BAT-25和BAT-26)和3個雙核苷酸位點(D2S123、D5S346和D17S250)。同時,專家組也制定Panel判讀標準:若5個微衛星位點中有2個或2個以上的微衛星位點不穩定,則為微衛星高度不穩定性(microsatellite instability-high, MSI-H);若有1個微衛星位點不穩定,則為微衛星低度不穩定性(microsatellite instability-low, MSI-L);若5個微衛星位點均穩定,則為微衛星穩定(microsatellite stability, MSS)[9]。2002年,美國NCI對MSI的檢測進行修訂和補充,推薦含有5個單核苷酸位點(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22和NR-24)構成的Pentaplex Panel,檢測靈敏度遠高于“2B3D”NCI Panel[10]。2004年,美國Promega公司發布全球首個商品化MSI檢測試劑盒;2006年,Promega Panel MSI檢測體系出現,將Pentaplex Panel中的NR-22替換為MONO-27,包括5個單核苷酸位點(BAT-25、BAT-26、NR-21、MONO-27和NR-24)和2個對照位點(Penta C、Penta D)[11]。目前,國內外權威指南和專家共識推薦MSI檢測方法主要是2B3D Panel和Promega Panel。

2015～2017年,大量臨床研究證實PD-1/PD-L1抑制劑對MSI-H/錯配修復功能缺陷(deficient mismatch repair, dMMR)實體瘤患者療效顯著[12-13]。2017年,美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)正式批準帕博利珠單抗用于MSI-H型晚期或轉移性實體瘤患者的治療。目前,MSI-H發生率高的實體瘤包括子宮內膜癌(20%～30%)、胃癌(15%～20%)和結直腸癌(12%～15%)[14]。中國每年新增MSI-H患者人數近30萬,美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)或中國臨床腫瘤學會(Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO)的最新指南,將MSI檢測作為結直腸癌、子宮內膜癌、小腸腺癌和胃癌一線治療方案的必要檢測。此外,行林奇綜合征篩查和接受免疫治療的實體瘤患者均推薦行MSI檢測[15-16]。

3 MSI的致病機制(MMR機制)

3.1 MMR組成與功能1964年,MMR系統闡述了細菌和酵母中的DNA切除-再合成過程,主要糾正在DNA中產生的錯配核苷酸或插入-缺失環的復制錯誤。MMR基因的產物是MMR蛋白,屬于核酸水解酶。DNA在復制過程中會不可避免地發生錯誤,而MMR系統起到負責監視和修正DNA復制和重組過程中的錯誤,使DNA能精確復制,保證遺傳的保守性和穩定性[17]。

MMR系統廣泛存在于生物體內,在大腸埃希菌(escherichia coli,E.coli)中發現MMR,即MutSLH依賴于MutS、MutL、MutH等基因編碼的產物。在E.coli的DNA復制過程中,新生鏈上約256個堿基對出現1次GATC序列,在被合成后的短時間內不會被甲基化,而此時模板鏈上的GATC序列已被甲基化。該差異使模板鏈與新生鏈暫時得以區分,為MutSLH-MMR特異性識別提供前提和基礎。MutS識別錯配或未配對堿基并與之結合,MutL參與形成復合體“MutL-MutS-DNA”,并激活MutH的核酸內切酶活性,在錯配位點附近(GATC)序列處將非甲基化的DNA鏈切割,然后核酸外切酶在解螺旋酶和單鏈DNA結合蛋白的協助下,將非甲基化的DNA序列從GATG位點至錯配位點整段去除。

目前,真菌和哺乳動物體內的MMR系統也開始得到進一步探索。研究發現多個MMR相關分子,主要包括5個MutS同源體(MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6)、4個MutL同源體(MLH1、MLH2/PMS1、MLH3、MLH4/PMS2)、MutH同源體和UvrD同源體[18]。人類MMR系統中的主要蛋白包括MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、PMS2和MLH3,它們以異源二聚體的形式相互作用。MSH2與MSH6或MSH3偶聯(分別形成MutSα和MutSβ復合物),2個異源二聚體均可識別新合成的DNA核苷酸鏈上的堿基錯配,并與錯配位點結合;MLH1與PMS2、PMS1或MLH3偶聯(分別形成MutLα、MutLβ或MutLγ復合物),與結合到DNA鏈上的MutSα或MutSβ形成暫時性的復合物啟動MMR,與有關的酶相互配合,切除含有錯配堿基的1段DNA鏈,以代替被切除的DNA鏈,完成含錯配堿基DNA核酸鏈的修復(圖2)。

圖2 MMR相關基因蛋白的具體組成結構及其形成復合物的作用機制

3.2 MMR與MSI的關系微衛星序列是DNA復制過程中最易發生錯配的序列,需要MMR相關蛋白修復。MMR是高度保守的細胞過程,在DNA復制過程中起重要作用。有研究證實,MMR使DNA復制的準確性提高100～1 000倍。若MMR功能缺陷,微衛星出現的復制錯誤得不到糾正并不斷累積,使微衛星序列長度或堿基組成發生改變稱為MSI。同時,導致基因組呈高突變表型,即MSI是MMR缺陷導致的結果,故可通過檢測MMR蛋白缺失反映MSI狀態。采用免疫組化法檢測腫瘤樣本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2表達,若4個MMR蛋白均陽性,則為錯配修復功能完整(mismatch repair proficient, pMMR);任一MMR蛋白缺失即為dMMR。通常dMMR相當于MSI-H表型,pMMR相當于MSI-L/MSS表型,根據免疫組化檢測結果可提示是否進行特定MMR基因的突變檢測。

4 MSI的臨床意義

MSI最早在結直腸癌中發現,其在結直腸癌、胃癌和子宮內膜癌等多種實體瘤中高發[19],在林奇綜合征篩查、化療藥物選擇、預后預測和免疫檢查點抑制劑獲益人群篩選等方面具有重要意義。2021年,美國NCCN指南推薦結直腸癌、子宮內膜癌、胃癌和小腸腺癌[20-22]的新確診患者常規檢測MSI,同時也推薦前列腺癌、胰腺癌等進行MSI檢測以指導免疫治療。CSCO結直腸癌診療指南推薦結直腸癌患者行MSI/MMR檢測,《結直腸癌分子檢測高通量測序中國專家共識》(2021)也將MSI/MMR列為“必須檢測的生物學標志物”[23]。《子宮內膜癌分子檢測中國專家共識》(2021)推薦對子宮內膜癌MMR/MSI患者行林奇綜合征篩查[24]。MSI檢測對結直腸癌和子宮內膜癌等多種實體瘤患者的治療,均有重要的臨床意義。

4.1 MSI檢測與林奇綜合征的關系林奇綜合征是由MMR基因(包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因)胚系致病性突變,或EPCAM基因失活導致MSH2啟動子高度甲基化,引起MSH2基因沉默所致的常染色體顯性遺傳性腫瘤綜合征。林奇綜合征發病時間早,約占結直腸癌發生率的3%,包括結直腸癌、子宮內膜癌、卵巢癌和胃癌等多種腫瘤[25]。由于MMR基因的功能失活,微衛星出現的復制錯誤得不到糾正并不斷累積,90%的林奇綜合征患者表現為dMMR和(或)MSI-H表型[26-27]。結直腸癌患者無論年齡和分期,行林奇綜合征篩查均有助于發現疾病。《遺傳性結直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識》推薦對MSI-H/dMMR的結直腸癌患者行MMR胚系檢測,以明確診斷林奇綜合征[28]。

4.2 MSI檢測與5-FU類化療藥物的選擇MSI檢測能夠預測結直腸癌輔助化療的療效,2003年一項回顧性研究表明,MSI-H結直腸癌Ⅱ/Ⅲ期患者未從5-FU的單藥輔助治療中獲益[29]。2010年,Sargent等[30]研究證實Ⅱ期 MSI-H的結腸癌患者術后預后較好,患者未從5-FU單藥化療中獲益,總生存期(overall survival, OS)縮短(HR=2.95)。國內外權威指南均指出,Ⅱ期MSI-H/dMMR的結直腸癌患者預后較好,不建議使用氟尿嘧啶類藥物治療。因此,Ⅱ期患者術后應常規行MSI檢測以制定個體化治療方案,MSI-H的結直腸癌患者應盡可能避免氟尿嘧啶的單藥輔助治療。

4.3 MSI檢測與預后分層關系MSI檢測對預測結直腸癌患者預后具有重要價值,MSI-H的結直腸癌患者有顯著的病理特征,包括近端結腸優勢、分化程度差、豐富的黏液成分和淋巴細胞浸潤增加[31]。MSI-H在結直腸癌患者發生率為15%,現有數據表明,MSI-H/dMMR是Ⅱ期結直腸癌患者的獨立預后指標,與MSI-L/pMMR患者相比,其OS長和復發風險低[32-33]。此外,MSI還可作為胃癌和小腸腺癌的預后因子。一項薈萃分析表明,MSI-H胃癌患者預后較好(HR=0.63)[34],但MSI-H胃癌患者未從5-FU單藥輔助化療獲益[30]。在小腸腺癌中,與MSS患者相比,MSI-H患者預后更佳[35]。

4.4 MSI檢測與免疫檢查點抑制劑獲益人群的關系2017年,美國FDA批準PD-1抗體帕博利珠單抗,用于不能手術或轉移的MSI-H/dMMR實體瘤患者的治療,已成為首個不限癌種、僅以生物學標志物進行治療選擇的抗腫瘤藥物[36-37]。隨后,CheckMate 142研究表明[13],納武利尤單抗治療MSI-H/dMMR轉移性結直腸癌患者的有效率為31%,中位無進展生存期(progression-free survival, PFS)為14.3個月。美國FDA批準納武利尤單抗治療MSI-H晚期結直腸癌患者。KEYNOTE-177研究表明,MSI-H/dMMR患者姑息一線應用帕博利珠單抗、標準化療靶向治療的客觀有效率(objective response rate, ORR)分別為43.8%和33.1%,中位PFS分別為16.5和8.2個月,差異有統計學意義[38],晚期結直腸癌一線用藥——帕博利珠單抗也再次獲批,MSI躋身為一線治療標志物。2021年,我國首款自主研發的PD-L1抗體恩沃利單抗經國家藥品監督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)獲批上市,用于MSI-H/dMMR成人晚期實體瘤患者治療,結直腸癌、胃癌和其他實體瘤患者的ORR為42.7%,疾病控制率為66.0%,抗腫瘤療效佳,為患者增加新的治療選擇[39]。總之,MSI-H/dMMR晚期結直腸癌患者可從PD-1/PD-L1治療中獲益,通過檢測MSI狀態可以預估免疫檢查點抑制劑的使用價值。

5 MSI的檢測方法

5.1 PCR+毛細管電泳技術采用多重熒光聚合酶鏈式反應擴增(quantitive fluorescent polymerase chain reaction, QF-PCR)結合毛細管電泳法,對微衛星位點和對照位點進行檢測。當微衛星位點用于判定樣本MSI狀態,對照位點除作為內部質控外,還可用于驗證腫瘤組織和正常組織是否來自同一個體。擴增體系中對每個檢測位點設置2條引物,其中1條標記特定熒光基團。引物與對應的基因組DNA模板結合進行擴增,產生特定長度和熒光標記的擴增產物,擴增產物用毛細管電泳檢測,通過特定長度的產物可以判定特定位點重復單元的重復狀態。

目前,PCR+毛細管電泳技術是MSI檢測的公認“金標準”。首先檢測時分別提取腫瘤樣本和對照樣本的DNA,其次使用試劑盒對正常組織和腫瘤組織的DNA進行PCR擴增,采用基因分析儀進行DNA片段分析,比較腫瘤組織和對照組織中各微衛星位點的電泳圖峰型和數目,判斷腫瘤組織相應位點的不穩定狀態。

為避免PCR實驗室污染,建議選用含有尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)防污染MSI檢測體系[40-41],在PCR擴增前消化可能存在含有尿嘧啶的擴增產物,保證實驗結果的準確性。

5.1.1位點選擇 目前,本文推薦選用已通過NMPA或FDA注冊審批要求的試劑盒位點組合,如:(1)BAT-25、BAT-26、D2S123、D17S250和D5S346[9];(2)BAT-25、BAT-26、NR-21、NR24、MONO-27和NR-27[42-44];(3)BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27[11,45]。同時為保證結果的準確性,可增加對照位點作為內部質控,常見對照位點為PentaC、PentaD和Amel等。

5.1.2檢測流程 檢測流程包括:DNA提取、PCR擴增、毛細管電泳分離樣品和結果分析。

5.2 PCR+高分辨率熔解曲線法除多重熒光PCR結合毛細管電泳法外,也可使用PCR結合高分辨率熔解曲線法檢測相關MSI標志物。高分辨率熔解曲線法通過在反應體系中加入飽和DNA雙鏈熒光染料,PCR結束后進行DNA雙鏈產物升溫解鏈反應獲取熒光信號。隨著溫度升高,DNA雙鏈氫鍵不斷被打開,熒光染料釋放,熒光強度逐漸降低。不同核酸片段有特異性溫度,即熒光強度變化曲線(又稱熔解曲線)。總的DNA雙螺旋結構降解一半的溫度稱為熔解溫度(Tm),不同序列DNA的Tm值不同。DNA中G-C含量與Tm值成正比,G-C含量越高,Tm值越高。高分辨率熔解曲線法通過比較不同樣本之間熔解曲線的位置和形狀上的差異,區分基因的分型。

熔解曲線技術被認為是最適合分辨單堿基的差異,因為飽和染料的使用,顯著提高了高分辨率熔解曲線法在單堿基突變、小片段插入/缺失方面檢測的靈敏度和分辨率。PCR結合高分辨率熔解曲線法檢測相關MSI單態性生物學標志物,該標志物一般為8～12個A或T堿基的單堿基重復序列(均聚物),分布在多個基因中。在正常細胞(即MMR功能正常的細胞)中堿基數目保持穩定(如11個)。在MMR功能缺陷的細胞(如癌細胞)中,這些均聚物更易變,并且通常觀察到1或2個堿基對的刪除,將長度為11的均聚物與長度為10的均聚物用于鑒別MMR的缺陷。

5.2.1位點選擇 Zhao等[46]對MMR缺陷的腫瘤行全基因組測序 (whole genome sequencing,WGS)分析,發現59個單核苷酸微衛星位點對MSI檢測具有代表意義,其中50個位點位于非翻譯區,提示組織特異性好。59個均聚物長度≤12 bp,與PCR技術和NGS技術都能較好地兼容。

目前,有2組較為成熟的標志物組合:(1)ACVR2A、BTBD7、DIDO1、MRE11、RYR3、SEC31A和SULF2;(2)EIF4E3、IFT140、PPP1CC、UBAC2、PRR5-ARHGAP8、ACVR2A、TAOK3和RBM14-RBM4。

5.2.2檢測流程 檢測流程包括:DNA提取、PCR擴增、高分辨率熔解檢測和結果分析。

5.3 NGS檢測MSI狀態可應用WGS、全外顯子組測序(whole exon sequencing,WES)或靶向測序(targeted gene sequencing,TGS)等NGS技術進行檢測[47]。美國NCCN結直腸癌臨床實踐指南(2022)推薦可使用經驗證的NGS Panel進行MSI檢測,尤其適用于需RAS和BRAF基因分型的轉移性結直腸癌患者[48-49];美國NCCN小腸腺癌臨床實踐指南(2023)中MSI檢測僅推薦經驗證的NGS Panel[50]。《結直腸癌及其他相關實體瘤微衛星不穩定性檢測中國專家共識》(2019)、《結直腸癌靶向治療中國專家共識》(2022)和《中國結直腸癌肝轉移診斷和綜合治療指南》(2023),亦推薦可通過經驗證的NGS法進行MSI檢測[16,51-52]。NGS檢測MSI的優勢:可覆蓋大量的微衛星位點,根據Panel設計不同,可檢測五至數十萬個的微衛星位點,可針對特異性腫瘤或泛腫瘤選擇不同的位點組合,對MSI狀態的評估更加全面[53-54]。

目前,NGS開發的Panel主要根據兩種檢測原理,通過不同的算法來檢測MSI。(1)通過比較腫瘤樣本與正常對照樣本(或正常人的基線水平)之間的微衛星重復序列長度分布,以不穩定位點比例是否超過既定閾值來判斷微衛星狀態。如MSI-sensor使用成對的腫瘤和正常WES數據,比較單核苷酸到五核苷酸重復微衛星的等位基因長度分布,并對每個分析的基因座應用χ2分析,給出對應于不穩定微衛星基因座百分比的MSI得分,閾值為3.5%[55]。MSI-ColonCore中微衛星狀態由樣本中不穩定基因座與正常基線水平的百分比來確定,閾值為40%[56]。(2)基于序列中的突變負荷和(或)微衛星中的突變負荷判斷MSI狀態,如MSI-seq Index是基于RNA測序數據和兩個測量值(PI-微衛星中的插入占RNA轉錄本中所有插入的比例;PD-微衛星中的缺失占RNA轉錄本中所有缺失的比例)的比率檢測MSI狀態,MSI-H的PI/PD比值<0.9。Nowak等[57]使用275個與癌癥相關的基因定向測序數據,把總突變負擔(>40 Mb)和單核苷酸微衛星中的INDELs(>5 Mb)定義為MSI-H。NGS平臺的MSI算法包括但不限于MSI-sensor、MSI-ColonCore、MSI-seq Index和Nowak等,隨著NGS的不斷發展,將陸續開發出更多新算法,不斷提高NGS檢測MSI的準確度和敏感度。

臨床和病理醫師對無法獲取腫瘤組織的患者,可使用外周血循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)進行MSI NGS檢測[16]。由于液體活檢診斷的準確性和靈敏度有限,目前不推薦常規行ctDNA的MSI NGS檢測,僅作為無法獲取腫瘤患者評價MSI狀態的替代檢測。

6 檢測的樣本類型與要求

6.1 腫瘤活檢或手術的新鮮標本建議標本離體后30 min內,置于液氮或-80 ℃保存,防止核酸降解。

6.2 福爾馬林固定石蠟包埋標本建議標本離體后30 min內,經10%中性福爾馬林充分固定,活檢小標本固定6～12 h,手術大標本應切開固定6～48 h。蠟塊保存的環境應溫濕度恒定,盡量減緩核酸降解。

6.3 石蠟切片數量要求福爾馬林固定石蠟包埋組織切片厚5～8 μm,切片數量≥5張,組織大小≥1 cm×1 cm。PCR+毛細管電泳技術檢測MSI需選擇癌旁組織或外周血作為對照樣本,PCR+高分辨率熔解曲線法和NGS技術無需對照樣本。

6.4 血液標本根據不同Panel檢測要求選擇合適抗凝劑的采血管或專用保存管,血液標本的采集、運輸和保存應嚴格按照相關操作流程進行,血液標本應在采集2 h內完成處理,避免反復凍融,防止核酸降解。

6.5 核酸樣本用量提取的基因組DNA可通過紫外分光光度儀或Qubit等檢測濃度,必要時對DNA樣本進行濃度調整和稀釋,確保單個PCR管中DNA的上樣量為10～250 ng。提取DNA樣本于2～8 ℃保存7天內檢測,于-20 ℃保存6個月內檢測。

本文建議使用Qubit檢測DNA濃度,由于提取的DNA樣本中混有不同比例RNA,紫外吸收法可能高估樣本中DNA的濃度,Qubit檢測加入DNA染料可準確檢測DNA濃度。

7 質量控制

標本的質量控制在檢測的前、中、后各過程中應注意以下幾點:(1)待測樣本需病理醫師進行可行性評估,一般腫瘤細胞比例>20%,細胞學樣本中腫瘤細胞數>200個。必要時可宏觀解剖或顯微切割富集腫瘤細胞;(2)需有獨立的切片設備和場地,使用一次性刀片、棉簽和漂片液,避免切片時樣本之間的交叉污染;(3)PCR+毛細管電泳法檢測MSI分子量內標需合格,采用經試劑盒配套驗證的分子量內標,各片段大小標注正確;如采用其他外配分子量內標則需進行驗證,保證無明顯熒光滲透現象;(4)微衛星位點檢測峰高,未出現超閾值(3500/3500xl、3500Dx/3500xLDx、GenReader 7010,峰高<30 000;3130xl,峰高<8 000);反之,應調整產物稀釋比例重新檢測,可取PCR產物≥2 μL用純化水稀釋 2～40倍,將稀釋后的產物進行毛細管電泳分離;(5)待檢測位點和內參位點引物熒光基團標記及其產物片段大小,符合預期;(6)空白對照以無核酸酶純水為模板進行擴增,無任何擴增產物;(7)以質控品為模板進行擴增,所有質控內參位點有效峰位置與預期相差<2 nt;(8)每個對照位點至少出現1個不低于100 RFU的產物峰,核實同一組腫瘤樣本和對照樣本的對照位點是否一致;每個微衛星位點至少出現一組連續峰,其最高峰≥100 RFU;(9)采用NGS檢測MSI的Panel,應做好實驗操作和生物信息等信息確認;(10)文庫的質量是影響NGS數據的關鍵,建議使用熒光定量或其他準確性高的方法鑒定,實驗中需設置陰陽性監控整個實驗流程;根據測序深度、測序覆蓋度、數據產出和運行時間等選擇合適的NGS測序平臺,并做相應指標的質控標準;(11)實驗操作、生物信息分析和報告分析等人員應取得上崗資質,參加必要的培訓;(12)進行月度或季度的數據統計,分析MSI-H的頻率與文獻報道是否相符;(13)實驗室應定期參加相應的室間質評或選擇同級別或高級別的實驗室,進行室間比對[47]。

8 結果判讀和報告模板

PCR+毛細管電泳技術和PCR+高分辨率熔解曲線法的結果判斷:出現2個及以上不穩定的核苷酸重復位點時,判定為MSI-H;出現1個或未出現不穩定的核苷酸重復位點時,判定為MSI-L/MSS。

目前,采用NGS檢測MSI的結果判斷尚缺乏統一標準。各實驗室需根據不同檢測平臺和Panel的性能確認設定MSI陽性閾值。

實驗室出具的報告內容除患者基本信息外,還需體現組織學病理診斷結果、腫瘤細胞含量、DNA質控信息、檢測方法、檢測位點、檢測結果、檢測結論、結果解釋、注意事項(可描述檢測技術的局限性、相關注意事項)和參考文獻等(表1)。若采用NGS檢測MSI狀態,則需另外注明測序質量評估指標[58]。

表1 微衛星不穩定性(MSI)檢測報告單