下丘腦/延髓軸調節創傷性顱腦損傷后外周脂質代謝

費茂星,李振興,羅詩樵,周夢良,王漢東,3

1.南京大學醫學院附屬金陵醫院神經外科,南京 210008; 2.南京醫科大學,南京 211166; 3.南京醫科大學附屬明基醫院神經外科,南京 210019

創傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是神經外科常見的急重癥之一,也是世界范圍內青壯年死亡的最常見原因[1-2]。其中,自主神經活性與能量代謝改變是導致TBI患者不良預后的重要原因,也是關系TBI患者營養管理決策的重要因素。既往研究表明,較多TBI患者表現出交感神經系統高反應性,重者可表現為陣發性交感興奮[3]。TBI后交感神經系統高反應性是否與能量代謝異常相關有待進一步探究。

既往研究表明,交感活性與下丘腦-延髓網絡連接改變存在密切的相關性[4]。下丘腦是調節全身能量代謝的重要部位,而下丘腦異?？赏ㄟ^激素調節等異常引起全身代謝紊亂[5-7]。延髓頭端中縫核(rostral medullary raphe region,rMR區)及延髓頭端腹外側區(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是調節交感神經活性、控制體溫心率等活動的中樞部位,而下丘腦通過對該區域形成神經網絡連接調節交感神經活性[4]。因此,TBI后下丘腦-延髓網絡連接改變可能在TBI后脂代謝改變中起重要作用。

外周脂質代謝在TBI后改變目前研究較少,肝臟及棕色脂肪是體內脂質代謝的重要參與者。TBI后肝臟及棕色脂肪出現何種變化仍需深入研究。同時,下丘腦相關網絡能否介導TBI后交感興奮以及影響肝臟和棕色脂肪代謝,仍有待進一步探索。在本研究中,筆者將針對TBI后下丘腦/延髓區域神經元激活情況及外周脂質代謝改變進行檢測,以探究兩者之間的相關性。

材料與方法

1 實驗動物與TBI模型

本實驗選用無特定病原體、周齡8周成年雄性C57BL/6小鼠,購自集萃藥康生物有限公司。實驗動物預先被移入實驗室動物房并適應1周,飼養期間小鼠自由進水進食,動物房恒濕(45%～50%)恒溫(23～25 ℃),室內燈光12 h明暗間隔循環模擬晝夜節律。將實驗動物隨機分為Sham組、TBI-1 d組、TBI-3 d組、TBI-7 d組,每組6只,TBI組通過重物撞擊制作TBI模型:重物質量為100 g,撞擊高度為3 cm,撞擊位置為前囟后方2 cm、右側旁開2 cm[8]。Sham組進行頭皮切開縫合處理;于對應時間點處死并留取相應標本。收集腦組織、棕色脂肪及肝臟標本分別行Western blot及免疫熒光染色。

2 改良油紅O染色及免疫熒光染色

對留取的組織樣本使用多聚甲醛固定24 h,蔗糖梯度脫水后行冰凍切片。改良油紅O染色試劑購于碧云天生物公司,油紅O染色具體步驟按說明書進行。染色工作液染色20 min后,洗滌封片,然后鏡下觀察拍照、統計分析。

冰凍切片復溫后多聚甲醛固定15 min,磷酸鹽緩沖溶液(PBS)浸洗后Triton通透處理、山羊血清封閉,而后4 ℃一抗孵育過夜,含0.2% Tween 20的PBS(PBST)浸洗后孵育另一種一抗過夜,PBST浸洗后孵育對應二抗。使用含DNA染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-Diamidino-2’-phenylindole,DAPI)抗熒光淬滅封片液封片,然后鏡下觀察拍照。

3 Western blot實驗

對留取的腦組織樣本及肝臟樣本按照操作步驟提取蛋白,應用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,按蛋白濃度調整加樣量,根據分組順序進行蛋白質凝膠電泳,電泳結束后將蛋白電轉至0.45 μm聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,4℃孵育一抗過夜,TBST清洗2遍后室溫孵育相應二抗1 h。電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)顯示液浸潤后于曝光儀器中拍照,后續通過Image J定量分析。

4 統計學分析

結 果

1 TBI后棕色脂肪及肝臟脂滴含量改變

棕色脂肪是體內熱量產生和能量代謝的重要場所,為檢測TBI后棕色脂肪脂質代謝情況,筆者留取Sham組、TBI后3 d及7 d小鼠肩胛間區棕色脂肪,通過油紅染色確定細胞內油脂大小(圖1a),通過分析油脂面積及相同視野下細胞數量反映棕色脂肪代謝情況(圖1b)。結果提示TBI后3 d及7 d肩胛間區棕色脂肪較Sham組明顯減少,同時TBI后單位面積內細胞量明顯增多,提示TBI后棕色脂肪代謝活動增強。

圖1 TBI后棕色脂肪及肝臟脂質代謝改變。a.對Sham組、TBI-3 d組、TBI-7 d組肩胛間區棕色脂肪進行改良油紅染色,顯微鏡鏡檢可見油脂相對面積在TBI造模后明顯減少;b.統計分析結果顯示相對脂滴面積/細胞數,Sham組明顯較TBI組多,**提示P<0.01,比例尺為50 μm;c.對Sham組、TBI-3 d組、TBI-7 d組肝臟組織進行PLIN2免疫熒光染色;d.統計分析結果提示TBI組中PLIN2免疫熒光強度明顯增高,**提示P<0.01,***提示P<0.001,比例尺為25 μm。PLIN2:脂滴包被蛋白2

肝臟是能量代謝的中心部位,為進一步明確肝臟脂質代謝情況,對Sham組及TBI組肝臟組織使用脂滴包被蛋白2(perilipin 2,PLIN2)進行冰凍切片免疫熒光染色(圖1c、d),結果提示TBI后肝臟細胞PLIN2陽性顆粒較Sham組明顯增多。這些結果提示TBI后肝臟出現明顯的脂質代謝負擔增加。

2 肝臟脂噬增強

為進一步明確肝臟脂質代謝情況,收集Sham組、TBI-1 d、3 d、7 d組肝臟標本提取蛋白后行Western blot檢測脂噬相關蛋白。結果提示,相較Sham組,TBI后自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ出現明顯增加(圖2a、b)。為進一步明確脂噬活動是否增加,也對脂噬相關蛋白激素敏感性脂酶(hormone sensitive lipase,HSL)、甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)進行檢測,結果同樣提示HSL、ATGL在TBI組中出現增高(圖2a、b)。這一結果提示TBI后肝臟脂質代謝活動增加。

圖2 TBI后肝臟脂噬增強。a.對收集的肝臟標本(Sham組、TBI-1 d、3 d、7 d組)進行Western blot染色,檢測指標包括自噬相關指標(Beclin1、LC3B)、脂質代謝相關指標(ATGL、HSL),內參蛋白為β-actin;b.統計分析結果顯示,相較對照組,TBI組Beclin1、ATGL、HSL不同程度增高,LC3BII/LC3BI比值在TBI-3 d及7 d也明顯增加。 ns差異無統計學意義,*P<0.05,**P<0.01。HSL:激素敏感性脂酶;ATGL:甘油三酯脂酶;LC3B:微管相關蛋白1輕鏈3β

3 TBI后下丘腦神經元激活

下丘腦是全身能量代謝重要的調節中樞,同時也是交感活動重要的調控區域。為了明確TBI后下丘腦神經元激活情況,通過對Sham組、TBI-3 d組腦組織切片行神經元激活標志蛋白c-Fos與NeuN免疫熒光共染;圖3結果提示,TBI組中下丘腦區與NeuN共定位c-Fos陽性細胞比例明顯增多,提示TBI后下丘腦區神經元激活增多。

圖3 TBI后下丘腦神經元激活。a.對Sham組、TBI-3d組腦組織下丘腦層面進行切片c-Fos免疫熒光染色,b.鏡檢見TBI-3 d組中c-Fos陽性細胞較Sham組明顯增高。比例尺為25 μm。NeuN:神經元胞核;c-Fos:FBJ骨肉瘤原癌基因蛋白

4 TBI后延髓區域神經元激活

下丘腦-中縫核/延髓頭端腹外側區域是中樞交感活動控制調節神經通路,其交感信號可調控心肺活動、棕色脂肪代謝及能量代謝過程。為進一步研究該區域神經元在TBI后變化,同樣對該區域冰凍切片標本行c-Fos與NeuN共定位染色。結果提示,rMR區域在TBI-1 d及TBI-3 d c-Fos陽性神經元明顯增多(圖4a、b),RVLM區熒光染色結果也同樣提示在TBI組中該區激活神經元比例增加(圖4c、d)。

圖4 TBI后延髓頭端腹外側區及中縫核神經元激活。對Sham組、TBI-1 d組、TBI-3 d組腦組織延髓層面進行切片行c-Fos免疫熒光染色,結果可見TBI組中rMR區(a、b)及RVLM區(c、d)c-Fos陽性細胞較對照組明顯增高。比例尺為50 μm。NeuN:神經元胞核;c-Fos: FBJ骨肉瘤原癌基因蛋白。Merge為相融圖

5 單細胞數據結果提示下丘腦POMC神經元TBI后改變

下丘腦區POMC神經元是全身能量代謝重要調節者,為進一步研究該群神經元在TBI后變化,通過對基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO)數據庫中GSM5938054、GSE207078數據進行分析[9],該數據集包含Sham組、輕型TBI組(mTBI)及爆炸傷TBI組(bTBI)腦室下區單細胞測序數據,通過對POMC陽性細胞進行提取(Sham組25個POMC陽性細胞、mTBI組28個陽性細胞、bTBI組29個陽性細胞)。GO分析結果提示,相較于Sham組,mTBI及bTBI組中突觸重塑、神經遞質轉運釋放、激素分泌調節等功能明顯富集(圖5a、c);Snx10、Stat5b、Chrm3、Ncoa5、Kcnh7(mTBI組vs.Sham組)、Prkdc、Cspg5、Camk2d、Gabbr2(bTBI組vs.Sham組)等與代謝調控、激素信號相關基因轉錄水平增高(圖5b、d),提示POMC神經元在TBI后功能活動改變可能與TBI后全身能量代謝改變存在關聯。

圖5 TBI后下丘腦POMC神經元改變。a.GO功能富集分析結果提示,相較Sham組,mTBI組POMC神經元突觸功能、囊泡活動、神經遞質分泌、激素調節等功能出現明顯富集;b.火山圖結果顯示Snx10、Stat5b、Chrm3、Ncoa5、Kcnh7等基因出現明顯變化;c.GO功能富集分析結果提示,相較Sham組,bTBI組POMC神經元突觸功能、囊泡活動、神經遞質分泌、激素調節等功能同樣出現明顯富集;d.火山圖結果顯示Prkdc、Cspg5、Camk2d、Gabbr2等基因出現明顯變化。Snx10:分選連接蛋白10;STAT5B:信號轉導與轉錄激活因子5B;Chrm3:膽堿能受體毒蕈堿3;Ncoa5:核受體輔激活因子5;Kcnh7:鉀電壓門控通道亞家族H成員7;Prkdc:蛋白激酶DNA活化催化亞基;Cspg5:硫酸軟骨素蛋白聚糖5;Camk2d:鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶II,δ;Gabbr2:γ-氨基丁酸B型受體亞單位2

討 論

能量代謝改變是TBI患者面臨的重要問題,在TBI急性期往往呈現負氮平衡及能量消耗狀態[10],因此,深入了解TBI能量代謝改變的病理機制對TBI后能量代謝管理具有重要意義。脂質代謝不僅與全身能量供應相關,在全身炎癥狀態、應激反應等活動中也扮演重要作用,而TBI后外周脂質代謝變化仍有待進一步研究。本研究中,筆者發現TBI后小鼠肩胛間區棕色脂肪脂滴面積出現明顯減少,提示TBI后棕色脂肪對脂質利用增多?？紤]到肝臟在脂質代謝中的重要作用,進一步對肝臟脂滴進行熒光染色,結果提示肝臟脂滴在TBI后增加。這與既往研究結果一致[11],然而肝臟脂質利用能力在TBI后是否發生改變仍缺少相應闡述。因此通過對脂噬相關蛋白進行檢測,發現TBI后肝臟脂噬蛋白增加,提示TBI后肝臟脂質代謝增強。結合臨床TBI患者交感活性增加,筆者推測外周脂質代謝改變可能與此有關。

下丘腦是人體能量代謝重要的調節中樞,在體溫、自主神經節律、糖脂代謝調節等活動中起到重要作用,其中下丘腦-延髓網狀連接是其調控信號傳遞的重要途經[3]。在本研究中,筆者發現TBI后下丘腦-rMR/ RVLM區神經元激活,同時單細胞數據分析結果提示TBI組中下丘腦POMC神經元在信號轉導、囊泡分泌等活動中出現明顯變化。TBI后交感興奮是較為明顯的表現,其發生對患者生存質量具有負面影響。考慮到下丘腦-rMR/ RVLM區神經連接通路是交感調節通路重要結構,結合本研究中TBI患者交感活性增高,因此筆者推測TBI后該神經通路的激活與臨床TBI患者出現的交感興奮癥狀存在密切相關性。

在目前的研究中,下丘腦相關神經環路調節的中樞神經交感信號在外周器官脂質代謝活動中具有重要的調控作用[12-13]。多項研究表明棕色脂肪受交感神經直接調節,離斷棕色脂肪交感神經連接可顯著減少其脂質代謝水平[14]。本研究中,TBI后棕色脂肪脂質水平明顯減少,提示TBI后交感神經興奮性增高可能是棕色脂肪脂質利用增多的原因。

同樣,肝臟在TBI后脂代謝改變或許也與交感神經興奮性增高密切相關。Torres等[15]通過對肝臟注射偽狂犬病病毒逆行性示蹤,結果提示肝臟接收來自腹腔-腸系膜上復合體與主動脈和腎上神經節的交感神經投射。同時交感神經激活可影響肝臟脂質代謝,促進低密度脂蛋白-甘油三脂的產生,并與肝臟脂肪變性密切相關[16]。在本研究中,筆者也觀察到,伴隨著TBI的中樞交感系統興奮,肝臟在TBI早期存在脂滴蓄積增加。然而,也同樣觀察到脂噬活動增強,提示肝臟脂質代謝利用能力增強。本研究中,筆者發現TBI后下丘腦-rMR/ RVLM區神經元的激活與棕色脂肪、肝臟脂質代謝活動存在明顯的相關性,提示其在TBI后脂質代謝改變中存在可能的調控作用,其臨床意義及具體作用機制仍有待深入研究。在未來研究中,筆者將進一步對下丘腦-延髓軸進行相應干預以明確TBI后中樞交感系統激活對全身脂質代謝的調控機制。

在本研究中,筆者通過免疫熒光染色及單細胞數據分析發現TBI后下丘腦-rMR/ RVLM區神經元激活增加,可能通過增加交感系統高反應性,促進棕色脂肪脂質代謝以及增加肝臟脂噬能力,提高肝臟脂質代謝水平。本研究著重關注下丘腦/延髓交感系統激活情況與外周脂質代謝相關性,為臨床TBI患者代謝改變提供理論支持,然而其具體機制仍有待進一步揭示。

作者貢獻聲明：費茂星:論文撰寫;李振興、羅詩樵:統計學分析;周夢良、王漢東:思路設計及文稿修改