過表達葡萄糖調節蛋白78 人乳腺癌細胞系HS578T、MDA-MB-231的構建

李艷敏，古麗拉萊·多力坤，馬西智，楊文月，單文豪，陳娜菲，周曉濤，2

1 新疆醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，烏魯木齊 830011；2 新疆地方病與分子生物學重點實驗室

乳腺癌是一種乳腺上皮組織惡性腫瘤，發病率已躍居全球惡性腫瘤發病率首位，是目前全世界女性癌癥死亡的主要原因[1-2］。三陰性乳腺癌是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表達都是陰性的的一種乳腺癌特殊亞型。80%～90%三陰性乳腺癌的病理為基底樣型乳腺癌[4］，占乳腺癌總數的15%～20%[5］。三陰性乳腺癌具有惡性程度較高、早期即可發生內臟轉移及骨轉移、復發率較高等特點，多數患者確診時病情已經進展至晚期，預后較差[6-7］。手術結合放化療、靶向治療等輔助方法的綜合治療是目前臨床常用的三陰性乳腺癌治療方法，但治療效果不佳，患者預后較差。葡萄糖調節蛋白 78（glucose regulated protein 78kD，GRP78）屬于熱休克蛋白Hsp70 亞家族[9］，是內質網標志性應激蛋白之一。內質網應激（ERS）時腫瘤細胞為了重建內質網的穩態和功能，細胞會啟動未折疊 蛋 白 反 應（unfolded protein response，UPR）。GRP78 是ERS 的關鍵蛋白，在ERS 時被大量誘導表達，協助UPR，發揮腫瘤細胞的自我保護作用，使其在應激環境中存活[10］。長期或嚴重的ERS 超出UPR 的負荷時，GRP78 則會通過活化ERS 凋亡通路來誘導細胞凋亡[11］。研究[12］發現，乳腺腫瘤組織中GRP78 高表達。進一步研究[14］發現，GRP78 的表達與乳腺癌細胞的侵襲性正相關，敲除細胞GRP78 基因后乳腺癌細胞的侵襲、轉移能力明顯下降。研究[15-16］報道發現，抑制 GRP78 蛋白表達可逆轉乳腺癌的多重耐藥，降低腫瘤細胞的侵襲轉移能力。因此，研究GRP78 在乳腺癌侵襲轉移中的具體作用機制，對乳腺癌轉移的治療新方法的研究提供了新方向。HS578T、MDA-MB-231 是目前較為經典的、具有高度遷移和侵襲能力的人乳腺癌細胞系，常用于三陰性乳腺癌的基礎研究。2023年6—9月，我們構建了GRP78過表達的HS578T 、MDA-MB-231細胞系，旨在為后續研究GRP78 蛋白在三陰性乳腺癌遷移、侵襲中的作用提供基礎，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒、試劑及儀器 293FT 細胞系（克隆分離株）、HS578T 細胞系、MDA-MB-231 由本實驗室冷凍保存。pDONR223-HSPA5 質粒載體購自美國Sigma，Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ和Not Ⅰ限 制 性 內 切 酶、DNAmarker、BCA蛋白定量試劑盒購自購自中國賽默飛世爾科技；質粒提取試劑盒購自北京天根；蛋白質Maker 購自上海臻諾生物科技；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購自北京Solarbio 科技有限公司；PVDF 膜購自美國默克；細胞培養基、胎牛血清購自美國Biological Industries；PCR鑒定試劑盒購自大連TaKaRa。

1.2 過表達GRP78 慢病毒載體pCDH-CMVGRP78-HA-EF1-Puro的構建及鑒定

1.2.1 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 的 構 建參考pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（病毒骨架載體，含有包裝信號，具有氨芐霉素抗性）的MCS 區和pDONR223-HSPA5-WT（GPR78）目的基因CDs 區，選擇EcoRⅠ、NotⅠ兩個酶切位點。根據GPR78 目的基因序列與EcoRⅠ、NotⅠ兩個酶切位點設計并合成一對特異性引物，上游引物為5'-CCGGAATTCATGAAGCTCTCCCTGGTG-3'（下劃線處為酶切位點EcoRⅠ），下游引物為5'-TAAAGCGGCCGCGGCGTAGTCAGGCACGTCGTAAGGATACAACTCATCTTTTTCTGCTGT-3'（下劃線處為酶切位點NotⅠ）。采用PCR 法擴增目的基因GRP78，使用EcoRⅠ和Not Ⅰ限制性內切酶分別切割pCDH-CMVMCS-EF1-Puro（切割后得到線性化載體CDH-CMVHA-EF1-Puro）和GPR78 基因PCR 產物。運用同源重組克隆技術將具有相同末端序列的CDH-CMVHA-EF1-Puro 和GRP78 插入片段連接，最終構建得到pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro。擴增目的基因GRP78 后得到2 006 bp 左右的目的條帶，符合預期結果。以pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 為病毒骨架載體，含有包裝信號，具有氨芐霉素抗性。利用EcoRⅠ和NotⅠ酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 和目的基因片段GRP78，得到線性化載體骨架，分子量在7 352 bp左右，插入片段分子量在2 006 bp左右。

1.2.2 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 的 鑒 定取大腸埃希菌，加入“1.2.1”中構建得到的pCDHCMV-GRP78-HA-EF1-Puro 共培養，取大腸埃希菌感受態細胞涂布，培養12 h 挑取陽性單菌落，接種于5 mL 含有 50 μg/mL 氨芐青霉素的 LB 液體培養基中，37 ℃、220 r 培養過夜，離心收集菌體沉淀，按質粒小提試劑盒說明書操作提取質粒。采用PCR 法擴增質粒，上游引物：5'-CCGGAATTCGCCACCATGAAGCTCTCCCTGGTG-3'（下劃線處為酶切位點EcoR Ⅰ）；下游引物：5'-TAAAGCGGCCGCGGCGTAGTCAGGCACGTCGTA-3'（下劃線處為酶切位點NotⅠ）。PCR 總反應體系為50 μL：cDNA5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，PreMix 25 μL，ddH2O 18 μL。使用EcoRⅠ重組質粒pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 進行單酶切， XbaⅠ和NotⅠ限制性內切酶進行雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，并送上海生工生物工程股份有限公司測序，鑒定pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 是否構建成功。

1.3 GRP78 過表達的HS578T 、MDA-MB-231 細胞系構建

1.3.1 GRP78 慢病毒顆粒制備 取對數生長期293FT 細胞按照4.2×106～4.3×106的數量均勻鋪入6 cm 細胞培養皿中。將pCDH-CMV-GRP78-HAEF1-Puro 混合液逐滴均勻加入293FT 細胞培養皿中，37 ℃孵育培養6 h 換液。顯微鏡下觀察GRP78慢病毒顆粒包裝情況，可看到隨培養時間延長，293FT 細胞逐漸愈合，細胞內出現空泡，在上清中含有高濃度的病毒顆粒. 培養48 h收集含GRP78慢病毒顆粒的上清液，4 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清，分裝到無菌EP管中，-80 ℃保存備用。

1.3.2 GRP78 過表達的HS578T 、MDA-MB-231 細胞系的構建方法 取對數生長期HS578T、MDAMB-231 細胞按照0.4×106的密度接種于3.5 cm 細胞培養皿中，培養24 h 后將含GRP78 慢病毒顆粒的上清液與培養基按照2∶1 比例，通過pB 轉染到細胞里，轉染24 h后更換培養基。轉染48 h后，在培養基中加入1∶500 稀釋嘌呤霉素，每2 天換液1 次，維持嘌呤霉素濃度為1∶2 000，篩選GRP78 過表達的HS578T 、MDA-MB-231細胞系。

1.3.3 GRP78 過表達的HS578T 、MDA-MB-231 細胞系鑒定 ①采用Western Blotting 法檢測“1.3.2”中HS578T 、MDA-MB-231 細 胞GRP78。 收 集“1.3.2”中感染pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 慢病毒的HS578T、MDA-MB-231 細胞，加入完全細胞裂解液充分裂解獲取總蛋白。采用BCA 試劑盒測量蛋白濃度后，每組取20 μL 蛋白進行12%SDSPAGE 凝膠電泳后轉移至孔徑為PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×Tris-鹽酸緩沖液（TBST）間隔15 min，重復洗滌3 次；加入一抗4 ℃搖床孵育過夜，1×TBST 間隔15 min，重復洗滌3 次；加入HRP 標記的二抗避光室溫孵育2 h，1×TBST 間隔15 min，重復洗滌3 次；加入ECL 顯影，觀察并記錄結果。②HS578T 細胞GRP78 蛋白亞細胞定位觀察 采用激光共聚焦顯微鏡觀察HS578T 、MDA-MB-231 細胞GRP78 蛋白亞細胞定位。與MDA-MB-231 乳腺癌細胞相比，HS578T 細胞體積較大，可用于細胞內分子定位。在24 孔細胞培養板上放好圓形細胞爬片，用多聚賴氨酸浸潤爬片后吸取去除，以每孔4×105密度接種GRP78 過表達的HS578T 細胞。PBS洗滌2 次，加入4%多聚甲醛固定細胞，室溫靜置15 min，1×PBS 洗滌3 次；小心取出玻片放置入孵育盒中，用含0.1%的Triton X-100 室溫通透20 min，1×PBS 洗滌3 次；加5% BSA 的封閉液加入培養皿中封閉1 h，棄去封閉液，滴加稀釋好的鼠源anti-HA，4 ℃孵育過夜；1×PBS 洗滌3 次，滴加稀釋的熒光二抗（抗鼠IgG-FITC），37 ℃孵育30 min；1×PBS 洗滌3 次，DAPI 工作液室溫避光孵育 5min，1×PBS 洗滌3 次，再加ddH2O 清洗2 次，滴加甘油并用透明指甲油封片，待完全干燥后使用激光共聚焦顯微鏡對HS578T 細胞中GRP78 蛋白進行定位，其中綠色熒光信號代表GRP78 蛋白，其中藍色熒光為細胞核。

2 結果

2.1 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 的鑒 定 結果 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 的PCR 產 物電泳結果可見分子量2 006 bp 左右的產物（見圖1A）；EcoRⅠ單酶切電泳圖酶切產物分子量約為9 369 bp，與目的條帶相符（見圖1B）；XbaⅠ和NotⅠ雙酶切電泳圖酶切產物分子量分別為7 352、2 017 bp，與目的條帶相符（見圖1C）。測序結果顯示，比對序列與HSPA5堿基序列100%符合，表明GPR78基因片段成功連接到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體上，pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 質粒構建成功。

圖1 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro的鑒定結果

2.2 HS578T、MDA-MB-231 細胞系GPR78 蛋白表達結果 定性檢測結果為HS578T、MDA-MB-231 細胞系中在78 kd 左右可見明顯電泳條帶（見圖2），說明HS578T 、MDA-MB-231細胞系中成功表達GPR78蛋白。定位檢查結果可見，外源性的GPR78 蛋白在HS578T細胞中穩定表達，且主要分布在細胞質中。

圖2 HS578T、MDA-MB-231細胞系GPR78蛋白電泳圖

3 討論

乳腺癌是全球女性癌癥主要致死原因之一，我國女性人口眾多，乳腺癌發病率和死亡率較高，成為公共衛生防控的主要負擔[17-18］。乳腺癌發病機制十分復雜，涉及多個癌基因、抑癌基因的異常表達，目前已發現許多與乳腺癌相關的基因，例如：p53、腫瘤轉移相關基因（MTA1）、黏附分子 （CD44）和熱休克蛋白（HSP70、HSP90 和GRP78）等[19-21］。因此，探索該類分子生物學表達，可以指導腫瘤的基因靶向治療，具有重要臨床價值。FERNANDEZ 等[22］研究發現與正常乳腺組織相比，大多數惡性乳腺腫瘤組織中GRP78mRNA 和蛋白均過表達。67%的乳腺癌患者在化療前表達高水平的GRP78，并表明GRP78 陽性與乳腺癌短期的復發有存在關聯[23］。

質粒是基因工程中常用的工具載體，人工構建的質粒可以集多種特性于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等[24］。常用的質粒載體有克隆載體、原核表達載體、真核表達載體、酵母表達載體與病毒表達載體[25］。其中真核表達質粒的轉染對于分裂增殖比較旺盛的體外培養細胞轉染效果較好，但表達的目的基因卻容易隨時間的延長而發生丟失[26］。在酵母菌中，存在大量的蛋白酶表達，這些蛋白酶有些定位于蛋白分泌途徑或作用于蛋白分泌途徑，外源蛋白表達后的折疊、糖基化等過程中可能會被錯誤剪切，直接導致蛋白表達量或活性下降。為了提高病毒載體的生物安全性和轉基因的效率，本研究中采用病毒骨架載體及包裝載體進行包裝和轉染，通過對病毒基因組進行調整和修飾來消除致病性基因、保留其感染活性，使之成為具有生物活性的基因載體。與前兩個載體質粒相比，包裝后的病毒顆粒可以利用其天然的感染性進入細胞，且病毒的感染、整合、轉錄、表達效率高、宿主涉及范圍大，可以感染分裂細胞和非分裂細胞；在結構方面，病毒基因組的結構簡單、分子背景簡單明了，其穩定性易于改造和制備。因此，我們采用慢病毒進行質粒包裝，獲得了高滴度的慢病毒載體，收集攜帶GRP78 基因的病毒上清液后，成功轉染了HS578T 和MDA-MB-231 細胞，并獲得持續穩定表達的乳腺癌細胞穩轉系。

本研究通過同源重組克隆技術構建出pCDHCMV-GRP78-HA-EF1-Puro質粒并選取293FT細胞檢測其感染效率，結果表明其可以成功轉染293FT細胞，且效果良好。將pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro質粒感染HS578T、MDA-MB-231 后，細胞存活率較高，表明包裝的過表達病毒載體轉染效率達到實驗要求，獲得GRP78 蛋白過表達細胞穩轉系。因為HA 標簽為外源蛋白，所以我們選用WESTERN-Blotting 技術對HA 蛋白進行鑒定，成功檢測到GRP78 蛋白在乳腺癌細胞穩轉系中的表達，在78 kDa 處出現特異性目的條帶，說明外源性GRP78 蛋白在穩轉系中成功表達，GRP78 過表達的乳腺癌細胞穩轉系構建成功，以便進一步研究GRP78 與乳腺癌細胞HS578T、MDA-MB-231 的相關性。由于HS578T 細胞相較于MDA-MB-231 細胞具有更大的體積，因此更適用于觀察蛋白的亞細胞定位。我們采用激光共聚焦顯微鏡檢測GRP78 蛋白的亞細胞定位，發現GRP78 蛋白主要分布在HS578T 細胞細胞質中。

綜上所述，本研究成功構建內質網應激蛋白GRP78 過表達的乳腺癌細胞穩轉系，并觀察到GRP78 主要在細胞質中表達，為進一步揭示GRP78在乳腺癌細胞中的機制建立平臺，從而為調控乳腺癌的發生、發展提供方向。