基于SNP標(biāo)記的小麥品種遺傳相似度及其檢測準(zhǔn)確度分析

許乃銀 金石橋 晉 芳 劉麗華 徐劍文 劉豐澤 任雪貞 孫 全 許 栩 龐斌雙,*

基于SNP標(biāo)記的小麥品種遺傳相似度及其檢測準(zhǔn)確度分析

許乃銀1金石橋2,*晉 芳2劉麗華3徐劍文1劉豐澤2任雪貞2孫 全2許 栩1龐斌雙3,*

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 江蘇南京 210014;2全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心, 北京 100125;3北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所, 北京 100097

遺傳相似度檢測的準(zhǔn)確度估計是對SNP標(biāo)記法在農(nóng)作物品種檢測體系中應(yīng)用的必要補充和完善。本研究基于2021年小麥品種SNP標(biāo)記法跨實驗室協(xié)同驗證實驗數(shù)據(jù), 分析了該方法的檢測準(zhǔn)確度及在品種間的遺傳相似度。分析結(jié)果表明: (1) 10個實驗室對55組小麥品種組合的標(biāo)記位點相似度檢測的總體準(zhǔn)確度約為98%。(2) GGE雙標(biāo)圖的品種遺傳關(guān)系功能圖顯示, 7組小麥品種的組內(nèi)遺傳相似度在95%以上, 其余組合的遺傳相似度較低。(3) 依據(jù)GGE雙標(biāo)圖的“正確度-精確度”功能圖和“準(zhǔn)確度排序”功能圖, 發(fā)現(xiàn)洛旱7號/洛旱11等品種組合的相似度檢測準(zhǔn)確度較高, 晉麥47/臨抗11的檢測準(zhǔn)確度一般, 而濟(jì)麥22/嬰泊700的檢測準(zhǔn)確度較差。(4) 10個實驗室的檢測準(zhǔn)確度存在顯著差異, 其中2個實驗室檢測的正確度、精確度和準(zhǔn)確度表現(xiàn)顯著差于其余實驗室。(5) 各實驗室檢測正確度的容許誤差分布于1.3%～1.9%之間, 平均為1.5%; 準(zhǔn)確度的容許誤差分布于1.5%～2.0%之間, 平均為1.7%。其中, Lab2和Lab3的檢測正確度和準(zhǔn)確度的容許誤差顯著差于其余實驗室。本研究構(gòu)建了SNP標(biāo)記法對品種相似性檢測的準(zhǔn)確度統(tǒng)計模型, 分析了品種組合和實驗室的檢測準(zhǔn)確度及其容許誤差, 采用GGE雙標(biāo)圖方法對檢測正確度、精確度和準(zhǔn)確度進(jìn)行可視化分析, 驗證了各實驗室對品種位點相似性檢測的準(zhǔn)確度和可靠性, 為SNP標(biāo)記法在農(nóng)作物品種遺傳相似性檢測中的準(zhǔn)確度評價提供了理論支持和應(yīng)用范例。

小麥(L.); GGE雙標(biāo)圖; SNP標(biāo)記; 遺傳相似度; 位點相似度; 準(zhǔn)確度

隨著農(nóng)作物種業(yè)市場化程度的不斷提高, 品種創(chuàng)新對振興國家種業(yè)、提高種業(yè)核心競爭力和實現(xiàn)種業(yè)高質(zhì)量發(fā)展變得越來越重要[1]。保護(hù)品種創(chuàng)新、解決品種同質(zhì)化以及打擊種子假冒套牌侵權(quán)的核心是快速、高效和科學(xué)地進(jìn)行品種真實性驗證和品種身份鑒定。近年來, 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標(biāo)記檢測技術(shù)在農(nóng)作物種子的真實性檢測、純度檢測和DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等方面被廣泛研究和應(yīng)用, 在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用[1-2]。隨著小麥(L.)[3]、玉米(L.)[4]和水稻(L.)[5]等主要農(nóng)作物《品種真實性鑒定 SNP標(biāo)記法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的頒布和實施, SNP標(biāo)記法已經(jīng)逐步成為我國品種管理、種子市場管理和品種權(quán)糾紛處理等領(lǐng)域最重要的新一代分子檢測技術(shù)。SNP標(biāo)記法主要通過比對品種間位點相似度或差異位點數(shù)確定品種間遺傳相似性, 并依據(jù)預(yù)設(shè)的差異位點數(shù)或差異位點比例閾值判定品種間遺傳關(guān)系和品種權(quán)屬性[1,6]。理論上, SNP標(biāo)記法的檢測效率和可靠性主要決定于標(biāo)記的數(shù)量及其代表性, 不受外界環(huán)境條件的影響, 不同實驗室、不同平臺對同樣的檢測樣品應(yīng)獲得相同的檢測結(jié)果[1]。然而, 每次檢測所采用的標(biāo)記數(shù)量有限, 相對于全基因組水平龐大的分子標(biāo)記數(shù)量庫僅為一小部分采樣, 不可避免引入抽樣誤差。實際操作中, 無法有效控制所有可能影響分子標(biāo)記檢測結(jié)果的潛在因素, 在每次檢測程序中都可能出現(xiàn)隨機(jī)誤差。因而在對檢測結(jié)果進(jìn)行分析和解釋過程中, 應(yīng)當(dāng)考慮和闡明這種不確定性。2023年國際種子檢驗協(xié)會(international seed testing association, ISTA)報道了24個豌豆品種在8個實驗室中的簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSR)標(biāo)記檢測驗證試驗, 發(fā)現(xiàn)實驗室間檢測結(jié)果的一致性約為90%[7]。檢測準(zhǔn)確度包括正確度與精確度, 正確度指測試結(jié)果與真值或參照值之間的符合度, 精確度指測試結(jié)果之間的一致程度[8]。在多環(huán)境品種試驗數(shù)據(jù)分析中廣泛應(yīng)用的基因型主效應(yīng)加基因型與環(huán)境互作效應(yīng)模型(genotype plus genotype by environment interaction model, GGE)雙標(biāo)圖[9-14]可以通過視圖直觀表達(dá)正確度、精確度和準(zhǔn)確度的關(guān)系。GGE雙標(biāo)圖技術(shù)與現(xiàn)代育種計劃中的基因組選擇(genome-wide selection, GS)模型相結(jié)合, 還可以提高基因組育種的選擇效率和預(yù)測精度[15]。關(guān)于如何基于SNP標(biāo)記檢測數(shù)據(jù)計算檢測準(zhǔn)確度, 以及如何利用GGE雙標(biāo)圖技術(shù)對準(zhǔn)確度進(jìn)行可視化分析, 文獻(xiàn)中尚未見報道。本研究以2021年全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心(簡稱全國農(nóng)技中心)組織實施的主要農(nóng)作物品種SNP標(biāo)記法檢測標(biāo)準(zhǔn)的跨實驗室協(xié)同驗證試驗中的小麥品種樣本檢測實驗數(shù)據(jù)為例, 構(gòu)建了SNP標(biāo)記法檢測準(zhǔn)確度統(tǒng)計模型, 并采用GGE雙標(biāo)圖方法對檢測準(zhǔn)確度進(jìn)行可視化分析和展示, 驗證了各實驗室對小麥品種位點相似性檢測的準(zhǔn)確度和可靠性, 為SNP標(biāo)記法檢測農(nóng)作物品種遺傳相似性的準(zhǔn)確度評價提供理論支持和應(yīng)用范例。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來源于2021年全國農(nóng)技中心組織開展的小麥品種真實性鑒定的SNP標(biāo)記法準(zhǔn)確度驗證實驗的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集。實驗由《小麥品種真實性鑒定 SNP標(biāo)記法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(簡稱“小麥SNP標(biāo)準(zhǔn)”)[3]制定單位北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥研究所在國家農(nóng)作物品種標(biāo)準(zhǔn)樣品庫中抽取11個品種的種子樣品, 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的要求、位點及引物組合、程序和方法檢測出各個種子樣品的96個SNP位點的基因型信息, 作為各實驗室SNP位點檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)參照值(reference value)[16]。全國農(nóng)技中心將各抽檢品種的0.5 g種子粉末統(tǒng)一分配給相關(guān)省市有代表性的種子質(zhì)量檢驗機(jī)構(gòu), 采用與標(biāo)準(zhǔn)制定單位相同的樣品、SNP位點及引物組合, 進(jìn)行重復(fù)性實驗, 以驗證標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法及SNP位點組合在多單位、多平臺技術(shù)條件下的可重復(fù)性、可行性、實用性及各實驗室檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。小麥96個SNP位點及競爭性等位基因特異性PCR (kompetitive allele- specific PCR, KASP)分型引物信息詳見小麥SNP標(biāo)準(zhǔn)[3]。承擔(dān)小麥SNP標(biāo)準(zhǔn)驗證的10個實驗室和11個抽樣小麥品種信息詳見表1。

表1 基于SNP標(biāo)記鑒定小麥品種遺傳相似性的實驗室和抽樣品種信息表

REF#為提供標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果作為參照的制標(biāo)單位。

REF#is a standard unit that provides standard test results as a reference.

1.2 統(tǒng)計分析方法

1.2.1 品種間位點相似度計算 采用“小麥品種真實性鑒定SNP標(biāo)記法”行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]推薦的SNP位點相似度(locus similarity, LS)為品種間遺傳相似度參數(shù)[6]?；?6個SNP位點的基因型對各實驗室檢測的品種間相互比對, 基因型相同用“1”表示, 不同用“0”表示, 數(shù)值總和即2個樣品間的相同位點數(shù), 據(jù)此計算品種間的位點相似度。任意品種間的平均位點相似度用該品種組合在各試驗室的位點相似度的平均值表示?；跇?biāo)準(zhǔn)參照值或各實驗室平均值計算的品種間位點相似度矩陣可作為品種位點相似度的參照值。計算公式如下:

實驗室內(nèi)品種間位點相似度,

基于參照品種間位點相似度,

式中,LS、NS和NT分別表示實驗室內(nèi)品種和的位點相似度、相同位點數(shù)和比對總位點數(shù);LS、NS和NT分別表示基于標(biāo)準(zhǔn)參照(r)的品種和的位點相似度、相同位點數(shù)和總位點數(shù)。

1.2.2 品種間位點相似度的檢測準(zhǔn)確度計算 檢測準(zhǔn)確度包括正確度與精確度。正確度指檢測結(jié)果與參照值之間的一致程度, 精確度指檢測結(jié)果之間的一致程度[8,16]。某實驗室檢測的任意2個品種間的位點相似度, 與基于標(biāo)準(zhǔn)參照值得出的相應(yīng)品種組合的位點相似度相比較的一致程度, 就是該品種組合相似度在該實驗室檢測的正確度。任意2個品種位點相似度在各實驗室檢測正確度的平均值表示該品種組合的平均檢測正確度, 而在實驗室內(nèi)不同測試次數(shù)間或不同實驗室間測試結(jié)果的一致性為精確度指標(biāo)。實驗室內(nèi)所有品種組合位點相似度檢測正確度的平均值表示該實驗室的總體檢測正確度, 各品種組合位點相似度檢測正確度間的平均標(biāo)準(zhǔn)差表示該實驗室的檢測精確度。準(zhǔn)確度為正確度和精確度平方根[8]。計算公式如下:

實驗室內(nèi)2個品種位點相似度的正確度,

2個品種位點相似度的平均正確度,

實驗室對品種位點相似度檢測的平均正確度,

2個品種位點相似度的準(zhǔn)確度,

實驗室對品種位點相似度檢測的準(zhǔn)確度,

1.2.3 基于二項分布的品種遺傳相似度檢測準(zhǔn)確度的容許誤差估計 各實驗室檢測的品種間基于96個SNP位點的基因型相互比對, 或與SNP標(biāo)準(zhǔn)參照值比對, 結(jié)果以“1, 0”表示, 從而形成具有二項分布(Binary distribution)特征的數(shù)據(jù)集[17]。由于實驗室檢測的不確定度為小概率事件, 故采用Wilson算法[18]計算準(zhǔn)確度的容許誤差。計算公式如下:

式中, Δ、、分別表示準(zhǔn)確度容許誤差、樣本容量、準(zhǔn)確度,0.05表示5%顯著水平的臨界值。

1.2.4 基于GGE雙標(biāo)圖的品種遺傳相似度和檢測準(zhǔn)確度可視化分析方法 依據(jù)各實驗室SNP檢測結(jié)果的相互比對分析形成的品種間位點相似度矩陣,借助GGE雙標(biāo)圖“性狀間關(guān)系”功能圖[13,19]構(gòu)建的“品種遺傳關(guān)系”功能圖, 對SNP檢測結(jié)果中的品種間遺傳相關(guān)模式進(jìn)行可視化分析。SNP檢測結(jié)果的品種間遺傳相關(guān)程度通過“品種遺傳關(guān)系”功能圖中各品種向量間的夾角大小反映, 夾角越小, 則相關(guān)性越強[13,19]。基于各實驗室檢測的品種位點相似度與基于參照值相比較得出“實驗室-品種組合”的正確度矩陣, 利用GGE雙標(biāo)圖“均值-穩(wěn)定性”功能圖[20]構(gòu)建SNP檢測結(jié)果的“正確度-精確度”功能圖, 其中,平均環(huán)境軸(average environment axis, AEA)指向檢測正確度大的方向; 通過原點垂直于AEA軸的縱軸(average environment coordinate, AEC)指向檢測精確度差的方向, 越接近于AEA軸, 則精確度越好。在“正確度-精確度”功能圖基礎(chǔ)上, 以標(biāo)準(zhǔn)參照或理想品種坐標(biāo)為圓心, 作同心圓構(gòu)建“準(zhǔn)確度排序”功能圖[20], 各品種組合或?qū)嶒炇覉D標(biāo)到同心圓圓心的距離表示檢測準(zhǔn)確度, 距離越小, 則檢測準(zhǔn)確度越好。采用統(tǒng)計軟件GGEbiplot[12](http://www.ggebiplot. com/)進(jìn)行雙標(biāo)圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品種間遺傳相似度及其檢測準(zhǔn)確度分析

11個抽檢小麥品種在10個實驗室檢測, 基于96個SNP位點進(jìn)行基因型兩兩比對, 品種間平均位點相似度及其檢測準(zhǔn)確度分析結(jié)果表明: (1) 在55對品種組合比對中(表2), 濟(jì)麥22/嬰泊700 (編號W01/02)、晉麥47/臨抗11 (W03/04)、洛旱7號/洛旱11 (W05/06)、揚麥158/揚麥11 (W07/08)、揚麥158/揚麥12 (W07/09)、揚麥11/揚麥12 (W08/09)和中科麥138/中科麥36 (W10/11)等7對品種組合的位點相似度在95%以上, 其中揚麥158/揚麥12 (W07/09)的位點相似度在98%以上; 其余品種組合間的位點相似度較低, 介于42%～62%之間。(2) GGE雙標(biāo)圖的“品種遺傳關(guān)系”功能圖(圖1-a)直觀表達(dá)了品種間的遺傳相關(guān)模式, 11個抽檢品種可劃分為5個相關(guān)性強的品種組合, 即濟(jì)麥22/嬰泊700 (編號W01/02)、晉麥47/臨抗11 (W03/04)、洛旱7號/洛旱11 (W05/06)、揚麥158/揚麥11/揚麥12 (W07/ 08/W09)和中科麥138/中科麥36 (W10/11)。(3) 55對品種組合間位點相似度檢測的總體準(zhǔn)確度約為98% (表2), 其中準(zhǔn)確度在99%以上的組合只有洛旱7號/洛旱11 (W05/06)和中科麥138/中科麥36 (W10/11), 準(zhǔn)確度在98%以上的組合數(shù)約占總比對組合數(shù)的45%, 準(zhǔn)確度在97%以上的組合數(shù)約占總比對組合數(shù)的85%, 準(zhǔn)確度在96%以上的組合數(shù)約占總比對組合數(shù)的96%, 其余組合的檢測準(zhǔn)確度均在95%以上。(4) 基于圖1-a和表2分析的品種間遺傳關(guān)系, 將遺傳相似度最高的品種組合及其在各實驗室檢測結(jié)果在圖1-b中直觀表達(dá), 對品種組合間的遺傳相關(guān)性及檢測誤差可視化分析表明, 不同實驗室對各品種組合的遺傳相似度檢測結(jié)果均不同程度地存在誤差, 但相對于品種組合間關(guān)系, 誤差較小, 表明實驗室檢測的準(zhǔn)確度總體較高。(5) 圖1表達(dá)的品種間遺傳相關(guān)性相比于品種間位點相似度矩陣(表2)更加直觀明確, 并可表達(dá)品種組合之間的相關(guān)性檢測的誤差模式。

2.2 小麥品種遺傳相似度檢測準(zhǔn)確度的GGE雙標(biāo)圖分析

各實驗室檢測的小麥品種間遺傳相似度相對于標(biāo)準(zhǔn)參照值可算得相應(yīng)的“實驗室-品種組合”正確度矩陣, 利用GGE雙標(biāo)圖可直觀分析品種間遺傳相似度檢測的準(zhǔn)確度。以上述7對位點相似度高的品種組合為例, 其“正確度-精確度”功能圖(圖2-a)和“準(zhǔn)確度排序”功能圖(圖2-b)分析表明, (1) 圖2-a表達(dá)了各品種組合間的位點相似度與標(biāo)準(zhǔn)參照值比較的檢測正確度和精確度, 圖中橫坐標(biāo)值與正確度正相關(guān), 縱坐標(biāo)的絕對值與精確度負(fù)相關(guān), 單箭頭的橫軸指向正確度大的方向, 雙箭頭的縱軸指向精確度差的方向。各品種組合的位點相似度檢測正確度由高到低依次排序為中科麥138/中科麥36 (W10/11)>洛旱7號/洛旱11 (W05/06)>揚麥158/揚麥11 (W07/08)>揚麥158/揚麥12 (W07/09)>揚麥11/揚麥12 (W08/09)>晉麥47/臨抗11 (W03/04)>濟(jì)麥22/嬰泊700 (W01/02)。各品種組合的檢測精確度由高到低依次排序為中科麥138/中科麥36 (W10/11)>洛旱7號/洛旱11 (W05/06)>揚麥11/揚麥12 (W08/09)>揚麥158/揚麥12 (W07/09)>揚麥158/揚麥11 (W07/08)>濟(jì)麥22/嬰泊700 (W01/02)>晉麥47/臨抗11 (W03/04)。(2) 圖2-b中各品種組合圖標(biāo)到同心圓圓心的歐氏距離表明各品種組合的準(zhǔn)確度大小, 越接近圓心, 準(zhǔn)確度越好。各品種組合的準(zhǔn)確度由高到低依次排序為中科麥138/中科麥36 (W10/11)>洛旱7號/洛旱11 (W05/06)>揚麥158/揚麥12 (W07/09)> 揚麥158/揚麥11 (W07/08)>揚麥11/揚麥12 (W08/ 09)>晉麥47/臨抗11 (W03/04)>濟(jì)麥22/嬰泊700 (W01/02)。

表2 小麥抽檢品種SNP位點相似度與檢測準(zhǔn)確度平均值矩陣

左下三角為小麥品種間SNP位點相似度矩陣, 右上三角為相應(yīng)的檢測準(zhǔn)確度矩陣。下畫線表示位點相似度高的品種組合。

The lower left triangle is the SNP locus similarity matrix among wheat varieties, and the upper right triangle is the corresponding detection accuracy matrix. The data underlined indicate the variety combinations with high locus similarity values.

圖1 基于小麥品種SNP位點相似度平均值的GGE雙標(biāo)圖“品種遺傳關(guān)系”功能圖(a)和“品種組合關(guān)系+誤差”功能圖(b)

大寫字母W后面的數(shù)字為品種編號, 具體品種名稱詳見表1。品種向量間的夾角表示品種間的遺傳相關(guān)性, 夾角越小則相關(guān)性越強。圖1-b中的藍(lán)色小點表示各實驗室檢測的品種組合相似性圖標(biāo), 其到品種組合圖標(biāo)的連線長短表示誤差大小, 連線越長誤差越大。

The uppercase W followed by the numbers represents variety codes and the specific name of the breeding is shown in Table 1. The angle between the cultivar vectors indicates the genetic correlation between the cultivars, and the smaller the angle, the stronger the correlation. The blue dot in Fig. 1-b represents the similarity mark of variety combination tested by each laboratory, and the length of the line from it to the variety combination mark represents the error size, and the longer the line, the larger the error.

圖2 基于標(biāo)準(zhǔn)參照的小麥品種遺傳相似度檢測準(zhǔn)確度GGE雙標(biāo)圖分析的“正確度-精確度”功能圖(a)和“準(zhǔn)確度排序”功能圖(b)

大寫字母W后面的數(shù)字為品種組合編號, 如W01/02表示品種組合W01和W02, 具體品種名稱詳見表1。PC1相當(dāng)于品種位點相似性檢測的正確度, PC2的絕對值相當(dāng)于精確度。圖2-a中, 單箭頭的橫軸指向正確度大的方向, 雙箭頭的縱軸指向精確度差的方向。圖2-b中的同心圓圓心為理想品種組合坐標(biāo), 品種組合圖標(biāo)到圓心的歐氏距離表示準(zhǔn)確度, 距離越小則準(zhǔn)確度越好。“+”為實驗室圖標(biāo)。

The uppercase W followed by numbers represents variety combination codes. For example, W01/02 indicates the wheat variety W01 compared to W02. See Table 1 for detail. PC1 corresponds to the trueness in variety locus similarity detection and the absolute value of PC2 corresponds to the precision. In Fig. 2-a, the single-arrowed horizontal axis points to the direction of higher accuracy, while the double-arrowed vertical axis points to the direction of lower precision. The origin of concentric circles in Figure 2-b is the ideal variety combination mark, and the Euclidean distance from the variety combination mark to the origin represents the detection accuracy. The smaller the distance, the better the accuracy. The plus sign “+” stand for variety comparison combination mark.

2.3 不同實驗室對小麥品種遺傳相似度檢測準(zhǔn)確度的GGE雙標(biāo)圖分析

各實驗室對55對小麥品種組合的SNP位點相似度檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參照值相比較算得的“實驗室-品種組合”正確度數(shù)據(jù)矩陣, 經(jīng)GGE雙標(biāo)圖分析繪制了實驗室對品種組合間位點相似度檢測的“正確度-精確度”功能圖(圖3-a)和“準(zhǔn)確度排序”功能圖(圖3-b)。結(jié)果表明, (1)圖3-a表達(dá)了各實驗室的檢測正確度和精確度, 各實驗室檢測的正確度由高到低依次排序為Lab8>Lab9>Lab1>Lab4>Lab7>Lab10>Lab5> Lab6>Lab2>Lab3, 其中Lab8、Lab9和Lab1的正確度最高, Lab4、Lab7、Lab10、Lab5和Lab6的正確度較高, Lab2和Lab3的正確度稍差。各實驗室的檢測精確度由高到低依次排序為Lab1>Lab8>Lab7> Lab10>Lab5> Lab9>Lab6>Lab4>Lab3>Lab2。其中, Lab1、Lab8、Lab7、Lab10、Lab5、Lab9、Lab6和Lab4的精確度好, 且相互間差異不大, 而Lab2和Lab3的精確度稍差。(2)圖3-b中各實驗室圖標(biāo)到標(biāo)準(zhǔn)參照圖標(biāo)(REF)的歐氏距離表示檢測準(zhǔn)確度, 各實驗室準(zhǔn)確度由高到低依次排序為Lab8>Lab1> Lab9>Lab4>Lab7>Lab10>Lab5>Lab6>Lab2>Lab3。其中, Lab8、Lab1和Lab9的準(zhǔn)確度最高, Lab4、Lab7、Lab10、Lab5和Lab6的準(zhǔn)確度較高, Lab2和Lab3的準(zhǔn)確度稍差。

圖3 實驗室對小麥品種遺傳相似度檢測準(zhǔn)確度GGE雙標(biāo)圖分析的“正確度-精確度”功能圖(a)和“準(zhǔn)確度排序”功能圖(b)

帶“*”的實驗室編號同表1, “+”表示品種組合圖標(biāo)。PC1相當(dāng)于品種位點相似性檢測的正確度, PC2的絕對值相當(dāng)于精確度。圖3-b中的同心圓圓心為標(biāo)準(zhǔn)參照坐標(biāo), 實驗室圖標(biāo)到圓心的歐氏距離表示準(zhǔn)確度, 距離越小則準(zhǔn)確度越好。

Lab codes prefixed with star sign “*” are the same as those given in Table 1. The plus sign “+” stands for variety comparison combination mark. PC1 corresponds to the trueness in variety locus similarity detection and the absolute value of PC2 corresponds to the precision. The origin of concentric circles in Fig. 3-b is the standard reference mark, and the Euclidean distance from the variety combination mark to the origin represents the detection accuracy. The smaller the distance, the better the accuracy.

2.4 各實驗室對小麥品種遺傳相似度檢測準(zhǔn)確度及其容許誤差估計

各實驗室對小麥品種SNP位點檢測的準(zhǔn)確度參數(shù)及其相應(yīng)的容許誤差分析結(jié)果表明(表3), (1) 不同實驗室的檢測結(jié)果的正確度分布于96.8%～99.1%之間, 平均正確度為98.3%。各實驗室檢測正確度由高到低的排序為Lab8>Lab9>Lab1>Lab7>Lab4> Lab10>Lab5>Lab6>Lab2>Lab3。其中, Lab2和Lab3的檢測正確度顯著差于其余實驗室。(2) 各實驗室的檢測精確度分布于1.1%～1.9%之間, 平均精確度為1.4%。各實驗室檢測精確度由好到差的排序為Lab8> Lab9>Lab1>Lab4>Lab7>Lab10>Lab5>Lab6>Lab2>Lab3。其中, Lab2和Lab3的檢測精確度顯著差于其余檢測單位。(3) 各實驗室的檢測準(zhǔn)確度分布于96.2%～98.5%之間, 平均準(zhǔn)確度為97.7%。各實驗室檢測準(zhǔn)確度由高到低的排序與正確度的排序相同。其中, Lab8、Lab9、Lab1和Lab7的準(zhǔn)確度在98%以上, Lab4、Lab10、Lab5和Lab6的準(zhǔn)確度在97%以上, Lab2和Lab3 的準(zhǔn)確度最低, 顯著低于其余實驗室。(4) 各實驗室檢測正確度的容許誤差分布于1.3%～ 1.9%之間, 平均為1.5%; 準(zhǔn)確度的容許誤差分布于1.5%～2.0%之間, 平均為1.7%。其中, Lab2和Lab3的檢測正確度和準(zhǔn)確度的容許誤差均顯著高于其余實驗室。

表3 不同實驗室SNP標(biāo)記法檢測準(zhǔn)確度及其容許誤差估計

同一列中標(biāo)有相同小寫字母的數(shù)據(jù)在0.05概率水平差異顯著。

Different lowercase letters in the same row indicate significantly different at the 0.05 probability level.

3 討論

3.1 基于SNP標(biāo)記法鑒定農(nóng)作物品種遺傳相似度的檢測誤差問題

SNP標(biāo)記技術(shù)近年來在農(nóng)作物種子的真實性檢測[21]、純度檢測[22]和指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建[23]等方面被廣泛研究和應(yīng)用。2021年陸續(xù)頒布實施了小麥、玉米和水稻等主要農(nóng)作物品種真實性鑒定SNP標(biāo)記法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3-5], 其他農(nóng)作物真實性鑒定的SNP標(biāo)記法技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)也在逐步研究和實施之中, SNP標(biāo)記法在農(nóng)作物種子真實性鑒定等領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用[1-2]。SNP標(biāo)記法的檢測可靠性雖然在理論上主要決定于分子標(biāo)記的數(shù)量、質(zhì)量及其最小等位變異頻率(minor allele frequency, MAF), 不受外界環(huán)境條件的影響, 不同實驗室或平臺對相同檢測樣品都能獲得同樣的檢測結(jié)果[1]。然而, 一些可能影響檢測結(jié)果的因素, 如試樣數(shù)量、DNA提取的質(zhì)量、檢測平臺或儀器設(shè)備性能差異、操作人員對標(biāo)準(zhǔn)掌握的熟練程度差異等并不能完全被控制, 不同批次或單位檢測結(jié)果間并不能做到完全一致, 檢測誤差仍不可能完全排除, 而這樣的誤差和不確定性必然影響SNP檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和應(yīng)用。2023年ISTA報道了多實驗室對豌豆品種SSR分子標(biāo)記檢測的驗證試驗, 實驗室檢測結(jié)果間的一致性只有約90%[7]。SNP標(biāo)記法的檢測準(zhǔn)確度體現(xiàn)了檢測結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性, 而準(zhǔn)確度又包括正確度與精確度(或精密度) 2個方面, 其中正確度指測試結(jié)果與真值或參照值之間的符合度, 精確度指測試結(jié)果之間的一致程度[8]。對于跨實驗室的協(xié)同檢測實驗, 各實驗室的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參照值相比, 即可計算檢測正確度; 如沒有設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)參照值, 各實驗室的平均檢測結(jié)果則可以作為參照進(jìn)行比較; 而同一單位檢測時, 重復(fù)測試結(jié)果的平均值可以作為為參照。本研究由“小麥SNP標(biāo)準(zhǔn)”的制標(biāo)單位提供標(biāo)準(zhǔn)參照值, 各實驗室采用SNP標(biāo)記法對統(tǒng)一提供的小麥種子樣品進(jìn)行檢測, 結(jié)果表明實驗室間檢測的正確度、精確度和準(zhǔn)確度均存在顯著差異, 其中2個實驗室的正確度、精確度和準(zhǔn)確度均顯著低于其他實驗室?？梢? SNP標(biāo)記法的檢測誤差是客觀存在的, 在制定判斷品種間差異性的臨界指標(biāo)和閾值時應(yīng)當(dāng)考慮檢測誤差和置信區(qū)間。鑒于SNP標(biāo)記法鑒定品種間遺傳相似性主要依據(jù)品種間或品種與參照比較的相同或差異位點數(shù)(率)進(jìn)行判斷, 位點基因型比對結(jié)果以“1、0”統(tǒng)計, 多位點比對結(jié)果形成具有二項分布特征的數(shù)據(jù)集[17],而且SNP檢測的不確定性通常為小概率事件, 故宜采用Wilson算法[18]計算準(zhǔn)確度的容許誤差。本研究表明, 各實驗室檢測正確度的容許誤差分布于1.3%～ 1.9%之間, 平均為1.5%; 準(zhǔn)確度的容許誤差分布于1.5%～2.0%之間, 平均為1.7%, 說明通過對實驗室的能力驗證和操作人員的技術(shù)培訓(xùn)以提高檢測準(zhǔn)確度、降低容許誤差區(qū)間是當(dāng)前亟待解決的問題。

3.2 利用GGE雙標(biāo)圖對農(nóng)作物品種指紋數(shù)據(jù)檢測準(zhǔn)確度的可視化分析

基于SNP標(biāo)記法等技術(shù)檢測的DNA指紋數(shù)據(jù)通常都可能存在檢測誤差的問題, 而指紋數(shù)據(jù)的檢測正確度、精確度和準(zhǔn)確度等統(tǒng)計參數(shù)又比較抽象和不易理解。GGE雙標(biāo)圖是農(nóng)作物多環(huán)境品種試驗中進(jìn)行品種評價、試驗環(huán)境評價和品種生態(tài)區(qū)劃分的最高效、直觀的統(tǒng)計和圖形展示工具, 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多環(huán)境品種試驗數(shù)據(jù)處理和可視化分析[13-14,24]。GGE雙標(biāo)圖的適用范圍并不局限于多環(huán)境品種試驗數(shù)據(jù)分析, 可以對所有二維數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析[25]。利用GGE雙標(biāo)圖對農(nóng)作物品種指紋數(shù)據(jù)的檢測準(zhǔn)確度進(jìn)行可視化分析, 可以直觀分析和展示各品種遺傳相關(guān)性模式, 展示各品種組合或檢測單位的檢測正確度、精確度和準(zhǔn)確度的關(guān)系, 以便更加直觀地理解指紋檢測數(shù)據(jù)的誤差問題。本研究依據(jù)各實驗室檢測結(jié)果的相互比對分析形成的品種間位點相似度矩陣, 構(gòu)建相當(dāng)于GGE雙標(biāo)圖“性狀間關(guān)系”功能圖[9,13,19]的“品種遺傳關(guān)系”功能圖和“品種遺傳關(guān)系+誤差”功能圖(圖1), 對品種間遺傳相關(guān)模式進(jìn)行可視化分析, 直觀展示了品種間及品種組合間的遺傳相關(guān)模式。同時, 基于“品種組合”和“實驗室-品種組合”正確度矩陣構(gòu)建的“正確度-精確度”功能圖(圖2-a和圖3-a), 具有GGE雙標(biāo)圖“均值-穩(wěn)定性”功能圖的特征與功能[20,26]。其中, AEA軸指向檢測正確度大的方向; 通過原點垂直于AEA軸的AEC軸指向檢測精確度差的方向, 越接近于AEA軸, 則精確度越好。在“正確度-精確度”功能圖基礎(chǔ)上構(gòu)建的“準(zhǔn)確度排序”功能圖, 相當(dāng)于GGE雙標(biāo)圖的“理想環(huán)境”或“理想品種”功能圖[20], 各品種組合或?qū)嶒炇覉D標(biāo)到同心圓圓心的距離代表了檢測準(zhǔn)確度, 距離越小, 則檢測越準(zhǔn)確。各品種組合的“準(zhǔn)確度排序”功能圖(圖2-b)展示了中科麥138/中科麥36和洛旱7號/洛旱11的檢測準(zhǔn)確度最高, 而濟(jì)麥22/嬰泊700的檢測準(zhǔn)確度相對較差。實驗室“準(zhǔn)確度排序”功能圖(圖3-b)直觀地展示了各實驗室準(zhǔn)確度由高到低依次排序。本研究表明, GGE雙標(biāo)圖技術(shù)應(yīng)用于SNP標(biāo)記檢測數(shù)據(jù), 可以更加直觀、高效、科學(xué)地展示品種間遺傳相關(guān)性模式和SNP標(biāo)記檢測的正確度、精確度和準(zhǔn)確度的關(guān)系, 從而為GGE雙標(biāo)圖在其他作物品種SNP標(biāo)記檢測數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用提供了范例。

4 結(jié)論

基于小麥品種真實性鑒定的96個SNP位點在10個實驗室的檢測結(jié)果, 55對品種組合位點相似度檢測的總體準(zhǔn)確度約為98%。7組小麥品種組合間的遺傳相似度在95%以上。洛旱7號/洛旱11相似度檢測的準(zhǔn)確度高, 晉麥47/臨抗11準(zhǔn)確度一般, 而濟(jì)麥22/嬰泊700的準(zhǔn)確度較差。各實驗室的檢測準(zhǔn)確度存在明顯差異, Lab2和Lab3檢測的正確度、精確度和準(zhǔn)確度表現(xiàn)均顯著差于其余實驗室。各實驗室檢測正確度的容許誤差分布于1.3%～1.9%之間, 平均為1.5%; 準(zhǔn)確度的容許誤差分布于1.5%～2.0%之間, 平均為1.7%。其中, Lab2和Lab3的容許誤差均顯著高于其余實驗室。

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Genetic similarity and its detection accuracy analysis of wheat varieties based on SNP markers

XU Nai-Yin1, JIN Shi-Qiao2,*, JIN Fang2, LIU Li-Hua3, XU Jian-Wen1, LIU Feng-Ze2, REN Xue-Zhen2, SUN Quan2, XU Xu1, and PANG Bin-Shuang3,*

1Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2National Agricultural Technical Extension and Service Center, Beijing 100125, China;3Institute of Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China

The accuracy estimation of genetic similarity detection of crop varieties is an indispensable supplement and improvement to the application of SNP marker method in crop variety detection technology system. In this study, based on the cross-laboratory collaborative validation test data using SNP molecular marker method in 2021, the genetic similarity among wheat varieties and the accuracy of SNP molecular marker method in variety similarity detection were analyzed. The results showed as follows: (1) The overall accuracy of marker locus similarity detection among 55 wheat variety combinations by 10 laboratories was approximately 98%. (2) The genetic relationship between varieties view of GGE biplot delineated the genetic relationship between varieties. The genetic similarity between seven combinations of wheat varieties was over 95%, and the genetic similarity of other combinations was relatively lower. (3) The “trueness-precision” view and “accuracy ranking” view of GGE biplot identified that the similarity detection accuracy of the variety combination Jinmai 47/Linkang 11 was on average, Jimai 22/Yingbo 700 was relatively lower, while Luohan 7/Luohan 11 and other variety combinations were relatively high. (4) Significant differences were existed in detection accuracy among the 10 laboratories, and the performances in detection trueness, precision and accuracy of two laboratories were significantly worse than those of other laboratories. (5) The tolerance error of the trueness of each laboratory ranged from 1.3% to 1.9%, with an average of 1.5%. The tolerance error of accuracy was distributed between 1.5% and 2.0%, with an average of 1.7%. Among them, the tolerance errors of the detection trueness and accuracy of Lab2 and Lab3 were significantly worse than those of the other laboratories. In this study, the detection accuracy statistical model of SNP marker method in detecting crop variety similarity was constructed to analyze the detection accuracy and the corresponding tolerance error of variety combination in different laboratories, and the GGE biplot techniques were adopted to visualize the detection trueness, precision, and accuracy, so as to verify the accuracy and reliability of the detection method for variety locus similarity in each laboratory. Therefore, the findings in this study could provide the theoretical support and application examples for the accuracy evaluation of SNP marker detection technique system for genetic similarity among crop varieties.

wheat (L.); GGE biplot; SNP marker; genetic similarity; locus similarity; accuracy

10.3724/SP.J.1006.2024.31044

本研究由國家科技創(chuàng)新重大項目(2022ZD04019)資助。

This study was supported by the National Scientific and Technological Innovation Major Project (2022ZD04019).

金石橋, E-mail: jinshiqiao@agri.gov.cn; 龐斌雙, E-mail: 1492196201@qq.com

E-mail: naiyin@126.com

2023-07-20;

2023-10-23;

2023-10-27.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231027.1619.002

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