甘藍型油菜373S溫敏不育基因在可育細胞質背景下的表達

王靜 張東鎖 董慧 孫妍妍 王珍珍 郭媛 胡勝武

摘 要 旨在明確甘藍型油菜溫敏不育系373S溫敏不育基因表達與特定細胞質之間的關系。以甘藍型油菜373S（微粉）為父本，以具有cam細胞質的Shaan 2B為母本，雜交、回交及自交得到BC1及F2代群體。結果表明，在上述具有cam細胞質的BC1及F2中，可育株與不育株的分離比分別符合3∶1與15∶1，表明該群體中不育性狀受2對基因控制。分離群體中的不育株表現出溫敏不育特征，其不育花形態與373S沒有明顯差別；與373S比較，該分離群體中的不育植株結實角果數及自交結實率有不同程度的降低，不育期時間率（不育期時間所占百分比）無顯著差異；花冠直徑、四強花藥長度、二弱花藥長度無明顯差異，花柄長度、花瓣長度、花瓣寬度、四強雄蕊長度、二弱雄蕊長度略有增加。細胞學觀察表明，該分離群體中的不育株小孢子的發育過程、染色體形態、胼胝質沉積與373S無明顯差異，均在花粉母細胞時期出現異常。本研究成功地將373S溫敏不育基因從pol細胞質導入cam細胞質，說明該溫敏不育性狀是由細胞核內溫敏不育基因導致，與細胞質背景無關。

關鍵詞 甘藍型油菜（Brassica napus L.）；溫敏基因；細胞質類型；雄性不育

油菜是中國乃至世界重要的油料作物，是人類食用植物油的重要來源，也是動物飼料中蛋白質的重要來源。中國油菜常年播種面積700萬hm2，總產超過1 400萬t，可生產優質食用油約550萬t，約占國產植物油50%；菜籽榨油后可獲得高蛋白飼用菜粕約800萬t。在油菜全價值鏈挖掘和全產業鏈開發中，還可以充分挖掘其菜用、蜜用、飼用、肥用、休閑觀光等價值［1］。2017年全國消費植物油總量為3 565萬t，其中，自產植物油為1 100萬t，自給率僅為30.8%，國產油料難以滿足消費需求，供需缺口與日俱增［2］。因此，大力發展油菜產業對于中國食用植物油安全供給、增加菜農收入、實現鄉村振興戰略具有非常重要的意義。油菜雜種優勢顯著，利用雜種優勢是顯著提高油菜產量的重要途徑之一。目前，油菜雜種優勢利用的主要途徑有細胞質雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）、細胞核雄性不育（Genic male sterility，GMS）、生態型雄性不育（Ecotype male sterility，EMS）、化學雜交劑誘導的雄性不育（Chemical hybridization agent （CHA）-induced male sterility，CIMS）和自交不親和（Self-incompatibility，SI）等［3］。生態型（光溫敏）雄性不育是一種特殊的不育系類型，其育性由自身基因和外界環境條件共同決定，特定生態條件下既可作為不育系進行制種，又可作為保持系自交繁殖，真正實現一系兩用。生態型雄性不育具有恢復譜廣、無細胞質負效應、配組自由、易選配出強優勢組合等優勢，在油菜雜種優勢利用中受到廣泛關注和研究。中國科學家在油菜光溫敏雄性不育材料的發掘及利用方面做了大量先驅工作，發現了一些光溫敏雄性不育材料，選育出湘雜油系列、贛兩油系列、華油雜系列等兩系雜交種，預示油菜兩系雜交種發展前景廣闊。目前，利用生態型雄性不育材料選育出一系列油菜雜交種，例如，利用湘油91S配制出的‘湘雜油5號［4-5］，利用其衍生系湘油402S配制出的‘湘雜油7號［6-7］；利用501-8S配制出的‘兩優586［8-9］，利用其衍生不育系選育出‘贛兩優2號‘贛兩優3號‘贛兩優5號‘秀油雜610等品種［10-13］。此外，報道的光溫敏雄性不育兩用系還有湘油104S［14］、溫敏不育系533S及其衍生系417S［15-16］、H50S［17］、160S［18］、SP2S［19］、TE5A［20］、K121S［21］等；光溫敏互作不育系有H90S、N196S、遵矮S等［22-24］。

甘藍型油菜生態型雄性不育系373S是由西北農林科技大學油菜研究中心（以下稱本課題組）發現的自然突變不育株，經多年選擇育成［25］。前期研究表明，373S的育性主要受溫度條件影響，表現為低溫可育、高溫不育，育性轉換的臨界值在10～12? ℃；細胞學研究結果表明，373S小孢子敗育起始于花粉母細胞時期；遺傳研究表明，373S的不育性狀受1對隱性核基因Bnmst1控制。分子鑒定結果表明，373S具有pol細胞質，其不育性狀遺傳機制與國內油菜雜交種育種中廣泛利用的pol CMS不同［26-27］。那么，373S溫敏不育基因的表達是否與pol細胞質背景有關？為回答這一科學問題，本研究以373S微量花粉為父本，以具有可育細胞質cam的甘藍型油菜為母本，將373S的溫敏不育基因通過雜交等手段，導入cam細胞質背景中，對其后代群體的不育株進行花器官形態觀察、育性調查、細胞學觀察以及遺傳研究，旨在明確373S溫敏不育基因與特定油菜細胞質之間是否存在互作關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜生態型雄性不育系373S、Shaan 2B、ZS9?? 3個自交系。在細胞質類型分子檢測結果的基礎上，以具有cam細胞質類型的Shaan 2B為母本，373S為父本，進行雜交獲得F1代，F1代自交獲得F2代，F1代與373S回交獲得BC1代。以上材料于2020年9月播種于陜西楊凌西北農林科技大學楊凌試驗基地，一般大田管理，小區? 種植。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞質類型鑒定 采取373S，以及Shaan 2B 與373S雜交衍生的具有cam細胞質背景的BC1代及F2代群體中不育株的幼嫩葉片，利用改良CTAB方法［28］提取基因組DNA。采用一步多重PCR方法鑒定所取材料的細胞質類型，所用3對PCR引物信息及試驗方法見Zhao等［29］文獻報道。

1.2.2 植株形態觀察及育性統計 2021年盛花期，調查統計Shaan 2B×373S衍生的具有cam細胞質背景的BC1及F2群體中可育株與不育株（≥5朵不育花的單株［27］）情況。上述群體中，可育株與不育株的分離比率利用χ2檢驗，確定該群體中不育性狀的遺傳行為。

在上述BC1及F2群體中，各隨機選取10株不育株，每個不育株隨機選取20朵花，對其花冠直徑、花柄長度、花瓣長度、花瓣寬度、四強雄蕊長度、二弱雄蕊長度、四強花藥長度、二弱花藥長度等指標進行統計；記載其總花期時間、不育期時間、計算不育時間率（不育期時間所占百分比），不育時間率=不育期時間/總花期時間×100；不育植株套袋自交，統計自交結實率，自交結實率=? 自交結實角果數/自交花朵總數；同時，對不育植株花序、花器官形態特征進行拍照記載。

1.2.3 細胞學觀察 花期選取ZS9、373S、Shaan 2B×373S衍生的BC1、F2群體中不育株的主花序，利用卡諾固定液［V（無水乙醇）∶V（冰乙? 酸）=3∶1］ 固定12～24 h，經梯度乙醇（100%，95%，85%，75%）脫水各2 h后，置于70%乙醇中保存備用。取固定材料的雄蕊，利用1%醋酸洋紅染液染色壓片觀察；苯胺藍染液（DAPI染液）染色壓片，進行染色體及胼胝質的觀察。細胞學觀察結果在OLYMPUS BX51（奧林巴斯，日本）熒光顯微鏡下拍照記錄。

1.3 數據處理

利用Excel 2013對試驗數據進行整理，SPSS 24.0對群體育性數據進行χ2檢驗，且對指標數據進行統計分析，差異顯著性分析使用Duncans法，P<0.05。

2 結果與分析

2.1 細胞質類型鑒定結果

為確定待測材料的細胞質類型，利用本課題組前期研發的一步多重PCR方法［30］對參試材料的細胞質類型進行鑒定。結果表明（圖1），不同的細胞質類型（IP-ogu、ogu、pol、nap、cam）擴增出特定的細胞質類型條帶，與Zhao等［29］報道結果相符。其中，373S擴增出747 bp條帶，為pol細胞質類型。Shaan? 2B擴增500 bp和800 bp兩條條帶，這兩條條帶亮度基本一致，為cam細胞質類型。以Shaan 2B為母本，以373S不育株（微粉）為父本，雜交得到的BC1及F2群體中不育株，擴增結果與Shaan? 2B帶型一致，為cam細胞質類型。

2.2 育性遺傳

對Shaan 2B×373S衍生的F1、BC1及F2群體進行育性調查（表1），結果顯示，F1植株全部表現為可育，而在總共87株的BC1群體中，可育株63株，不育株24株，分離比符合3∶1（P>? 0.05），在總共406株的F2群體中，可育株386株，不育株20株，分離比符合15∶1（P>0.05）。育性分離比結果說明，由373S衍生的cam細胞質類型的群體中，其不育性狀受2對隱性基因控制。結果表明，373S的溫敏基因已成功導入cam細胞質類型內，373S溫敏不育基因的表達與特定細胞質背景（pol）無關。

2.3 不同細胞質背景下的不育植株形態學觀察及單花性狀調查

觀察具有pol細胞質背景的373S植株，以及Shaan 2B×373S衍生的具有cam細胞質背景的BC1及F2群體中不育植株的育性變化、單花形態和花粉活力情況，結果發現三者初花期時，同一花序底端所開花均為不育花，雄蕊退化，無花粉或微量花粉；隨著田間環境條件的轉變，花序頂端新開放的花朵育性開始轉變為可育狀態，花藥形態飽滿，正常開裂，釋放花粉，期間，有多級育性花并存。兩種不同細胞質背景的生態不育株，植株花的育性均隨田間環境條件的變化而發生轉變，同一花序中出現可育花和不育花并存的現象，育性表現為環境敏感不育（圖2-A1～C1）。對其不育花單花觀察發現，其單花形態沒有明顯差異。花器官外形總體來看，萼片、花瓣、雌蕊發育均正常，但雄蕊退化，導致不育花花冠正面均看不到雄蕊，花絲長度明顯變短，花藥干癟萎縮，高度不及柱頭（圖2-A2～C2）。分別對其不育花花粉活力進行測定，發現其花粉育性表現為徹底不育（圖2-? A3～C3）。

為探究其不育期時間、結實率及花器官性狀之間是否存在差異，對所取不育材料進行育性統計調查及花器官性狀調查。結果表明，373S、Shaan 2B×373S衍生的BC1及F2群體中不育株的不育期時間與花期總時間、不育時間率無顯著差異。結實率方面，與373S相比，Shaan 2B×373S衍生的BC1及F2群體中，不育株的自交結實率有所降低（表2）。花器官性狀調查發現（表3），除花冠直徑、四強花藥長度、二弱花藥長度外，Shaan?? 2B×373S衍生的BC1及F2群體中不育株的其他5個指標（花柄長度、花瓣長度、花瓣寬度、四強雄蕊長度、二弱雄蕊長度）比373S顯著增加。

2.4 不同細胞質背景下的不育株花藥敗育的細胞學觀察

通過對不同細胞質背景下的油菜溫敏雄性不育材料小孢子發育觀察，研究其小孢子在主要細胞學發育時期是否存在差異。結果表明，與可育植株（圖3-F1）相比，373S及其衍生的不育植株均在花粉母細胞時期出現異常（圖3-A1～C1），可育花藥的花粉母細胞周圍被圓潤的胼胝質層包裹，而不育花藥周圍胼胝質稀薄，但均能進行減數分裂且形成四分體結構。四分體時期，373S及其衍生的cam細胞質背景的不育花藥周圍胼胝質均明顯薄于可育花藥（圖3-F2～C2）。隨后，胼胝質解體，小孢子釋放，此時可育小孢子與不育小孢子形態出現明顯異常，可育小孢子花粉壁形成，外形圓潤（圖3-F3），而不同細胞質背景下的不育小孢子花粉外壁形狀異常且不規則，出現橢圓形、多邊形等異常形狀（圖3-A3～C3）。之后，小孢子進行有絲分裂，可育小孢子體積逐步增大，而不育小孢子的體積無明顯變化（圖3-F3～C3）。成熟期，可育花粉粒細胞質分布均勻，形態飽滿，而不育花粉粒只剩花粉空殼，花粉敗育（圖3-F5～C5）。在花藥發育的整個時期內，不論是pol細胞質背景的373S，還是其衍生出的cam細胞質背景的不育植株，在相同時期內，其小孢子發育形態等無明顯差異。

為探究花藥發育期間核內染色體形態是否存在差異，對所取材料的花藥進行DAPI染色觀察。結果表明，與可育花藥相比，兩種不同細胞質背景下的不育株，在花粉母細胞減數分裂期，核內染色體出現異常，Shaan 2B×373S衍生的BC1及F2群體中不育株花藥減數分裂不同步（圖4-B1，4-C1），373S不育花藥呈團狀且黏連狀態（圖4-A1）。四分體時期，pol細胞質背景373S及衍生的cam細胞質背景的BC1代及F2代中不育株的不育花藥其四分體熒光信號均模糊，與可育花藥清晰的熒光信號成明顯對比（圖4-F2～C2）。成熟花粉粒時期，可育花粉粒核內染色體熒光信號強烈，而不育花粉粒均無熒光信號（圖4-F3～C3）。對其胼胝質沉積模式觀察發現，可育花藥的胼胝質圓潤清晰，不育花藥其熒光信號在花粉母細胞時期便出現模糊現象（圖5-F1～c1）。四分體時期，不育花藥的四分體體積均小于可育花藥（圖5-F2～C2），其胼胝質厚度也明顯薄于可育四分體，但在373S及衍生的cam細胞質背景的不育花藥之間，其發育大小及胼胝質厚度無明顯差異（圖5-f2～c2）。

3 討論與結論

利用雜種優勢可提高作物產量品質，是作物育種的重要途徑。生態型雄性不育材料的發現，促使作物雜種優勢利用由“三系”向“兩系”轉變，因其育性受自身基因型和外界環境因素共同調控，其遺傳機制也復雜多樣。研究表明，油菜生態不育系501-8S［30］、104S［14］、Huiyou50S［31］、TE5A［20］等均屬于單基因遺傳模式；417S［32］、SP2S［19］、100S［33］其育性則由2對基因控制，屬于雙基因遺傳模式；3基因及以上遺傳模式則包括湘油91S、H90S、芥菜型油菜溫敏核不育系K121S［34-36］；甘藍型油菜細胞質生態雄性不育兩用系AB1［37］及其衍生系8-8112AB［38］等則屬于質量-數量遺傳。本課題組前期對373S的遺傳研究表明，其育性受1對隱性核基因控制，且具有pol細胞質背景［27-28］。本研究以373S（微粉）為父本，通過雜交手段嘗試將其溫敏不育基因導入可育細胞質cam背景中，以此探究該溫敏不育基因的表達與細胞質背景之間的關系。結果表明，由373S衍生的cam細胞質類型的BC1及F2群體中，均有不育株出現，且表現為溫敏不育特性，表明373S溫敏不育基因已成功導入cam細胞質背景中，且能夠正常表達，從而使植株表現為溫敏

不育性狀。但對BC1群體及F2群體中，可育株與不育株的分離比的卡方檢驗表明，373S衍生的cam細胞質類型的后代其不育性狀受2對獨立基因控制，表現為隱性，這與前期研究的373S不育性狀受1對隱性基因控制的結果有差異。推測出現這種現象的原因，可能是不同的油菜親本與373S之間存在的育性基因數目有差異，在一些親本中僅有1對基因差異，在另外一些親本中存在2對基因差異。筆者正在對出現這種遺傳行為的原因，進行經典遺傳學和分子標記驗證。

對生態型雄性不育材料進行細胞學觀察，能夠發現其敗育時期及特征，有助于研究揭示其敗育機理。前人研究表明，反型生態不育系533S無法分化出正常的花粉囊，屬于孢原細胞敗育型［39］。SP2S、TE5A由于減數分裂時期胼胝質降解滯后導致不育，屬于花粉母細胞敗育型，其中SP2S還出現絨氈層細胞空泡化現象［19］，但TE5A的絨氈層發育正常［40］。生態型雄性不育系H50S、反型溫敏不育系Huiyou50S均在單核時期出現異常現象，其中，H50S在此時期絨氈層降解緩慢，細胞核呈現解體［17］，而Huiyou50S其絨氈層在單核后期迅速降解，兩者均屬于小孢子發育時期敗育型［41］。本研究發現，373S中不育基因在不同細胞質背景下的不育株花藥均在花粉母細胞時期出現異常現象。由373S衍生出的cam細胞質類型的不育株其核內染色體在花粉母細胞時期出現降解現象，減數分裂不同步、胼胝質層稀薄等；在小孢子時期，其花粉外壁不規則，體積不增大，直至敗育。

本研究結果表明，調控373S育性的溫敏基因在不同細胞質背景下表達，不同細胞質溫敏不育材料間小孢子發育行為無明顯差異，溫敏基因的表達與pol細胞質背景無關。該研究結果將為分離克隆油菜373S溫敏不育基因、明確其雄性不育機理及育種利用奠定基礎。

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Expression of Thermo-sensitive? Male Sterility Gene in Normal Cytoplasmic Type Derived from? TGMS Line 373S （Brassica napus）

Abstract This study investigated the relationship between the thermo-sensitive male sterile gene and specific cytoplasmic type in thermo-sensitive genic male sterile （TGMS） line 373S in Brassica napus L.，with the aim of advancing the understanding of its male sterility mechanism and utilization in two-line hybrid breeding.This study used the? female parent line Shaan 2B with normal cytoplasmic type cam and the TGMS line 373S as the male parent，in a cross，resulting in the separation ratios of fertile and sterile plants at 3∶1 and 15∶1 in BC1 and F2 population，respectively，suggesting? that the male sterility trait was controlled by two pairs of recessive genes in this population. The sterile plants in the BC1 and F2 populations exhibited thermo-sensitive sterility.Compared with the line 373S，the seed-setting rate of male sterile plants slightly decreased，and the male sterile period had no significant difference in the segregated populations. Additionally，there were no significant differences in the corolla diameter，length of four stronger stamens anther，and length of two weaker stamens anther，while a slightly increase was observed in the length of stalk，length of petal，width of petal，length of four stronger stamens and length of two weaker stamens in the segregated populations. Cytological observation revealed abnormal? microspores at pollen mother cell stage in male sterile plants in the segregated populations in terms of anther development stage，chromosome morphology and callose deposition，with no differences compared with the line 373S. These findings suggest that the TGMS gene（s） in the line 373S is successfully introduced from pol? to cam cytoplasm，and the TGMS trait of 373S is caused by the TGMS gene（s） in the nucleus，independent of the cytoplasmic background.

Key words Brassica napus；Thermo-sensitive sterility gene；Cytoplasmic types；Male sterile