青海駱駝線粒體DNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究

高雪 晁生玉 王啟菊 孟克達(dá)拉 烏蘭巴特爾 賈功雪

摘 要 旨在研究青海駱駝遺傳多樣性，揭示青海駱駝的母系起源進(jìn)化。采集柴達(dá)木地區(qū)3個(gè)青海駱駝?lì)惾憾M織樣品88份并提取基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增和基因測序分析線粒體DNA D-loop序列，并與蒙古、內(nèi)蒙古雙峰駝進(jìn)行比較。結(jié)果表明：D-loop序列中共檢測到96個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，定義了27種單倍型。3個(gè)青海駱駝?lì)惾赫加?6個(gè)單倍型，而蒙古雙峰駝獨(dú)有7個(gè)單倍型，內(nèi)蒙古雙峰駝獨(dú)有4個(gè)單倍型。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示出兩個(gè)獨(dú)立的分支：第一支為青海駱駝3個(gè)類群與蒙古雙峰駝，且德令哈雙峰駝與其他兩個(gè)類群間存在明顯界限；第二支為內(nèi)蒙古雙峰駝。青海駱駝與內(nèi)蒙古雙峰駝的遺傳距離均較遠(yuǎn)，但與蒙古雙峰駝的遺傳距離較近。因此，青海駱駝母系起源更傾向于蒙古雙峰駝而非內(nèi)蒙古雙峰駝。

關(guān)鍵詞 柴達(dá)木雙峰駝；線粒體DNA；系統(tǒng)發(fā)育；遺傳多樣性；單倍型

青海駱駝是中國優(yōu)良的地方雙峰駝（Bactrian camel，Camelus bactrianus）品種之一，主要分布于青海省柴達(dá)木盆地境內(nèi)的荒漠、半荒漠或半荒漠灌叢草場，是世界分布海拔最高的駱駝品種。作為當(dāng)?shù)刂匾纳a(chǎn)生活資料，青海駱駝的產(chǎn)肉、產(chǎn)絨、產(chǎn)乳、役用性能對于社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)[1]。然而，隨著飼養(yǎng)模式的落后、養(yǎng)殖收益的下降與經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)化效率的不足，青海駱駝數(shù)量迅速由1983年的28 100峰降至2015年的6 668峰[2]。此后隨著品種保護(hù)工作的重視，青海駱駝數(shù)量得到了逐步的恢復(fù)，2018年已恢復(fù)至10 304峰。

關(guān)于青海駱駝的起源一直存有爭議，目前較為明確的是青海土著駱駝自13世紀(jì)以來長期經(jīng)歷蒙古駱駝的血液滲透，形成了以蒙古駱駝為主要成分的混血種[3]。線粒體DNA（Mitochondrion DNA，mtDNA）具備嚴(yán)格的母系遺傳特征并且在世代傳遞中幾乎不發(fā)生重組，因此常被用于研究哺乳動物品種起源與系統(tǒng)發(fā)育。mtDNA D-loop區(qū)由于進(jìn)化速度快、變異水平高，是最常用的種群遺傳多樣性研究標(biāo)記之一[4-5]。多項(xiàng)研究利用mtDNA探討了國內(nèi)外駱駝品種的遺傳多樣性與種群進(jìn)化關(guān)系[6-7]，然而青海駱駝的品種起源與遺傳特征仍未得到充分闡明。因此，本研究借助mtDNA D-loop序列對青海駱駝的3個(gè)典型類群（都蘭、德令哈、莫河）進(jìn)行分析，并與蒙古、內(nèi)蒙古雙峰駝D-loop序列進(jìn)行比較，以闡明青海駱駝不同類群及其與蒙古、內(nèi)蒙古雙峰駝間的進(jìn)化關(guān)系，為青海駱駝資源的保護(hù)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及樣品

本試驗(yàn)共采集88份青海駱駝耳組織樣品，覆蓋范圍包括都蘭、德令哈和莫河3個(gè)典型類群，分別采自青海省海西蒙古族藏族自治州德令哈市蓄集鄉(xiāng)、都蘭縣香日德鎮(zhèn)與烏蘭縣茶卡鎮(zhèn)。樣品保存于裝有75%酒精的離心管中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后于-80 ℃條件下保存。采樣點(diǎn)及樣本信息見表1。

1.2 儀器及試劑

StarSpin柱式動物DNA提取試劑盒（D111）、StarPrep快速膠回收試劑盒（D205）與 ?2×Taq PCR StarMix試劑盒（A012）購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；Nanodrop超微量分光光度計(jì)（ND1000）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR儀（A200）購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司。

1.3 總DNA的提取

取青海駱駝耳組織樣品0.1 g，使用DNA提取試劑盒提取總DNA，并使用超微量分光光度計(jì)測定DNA濃度與質(zhì)量，隨后將樣品濃度稀釋至100 ng/μL。

1.4 D-loop序列的擴(kuò)增與測序

使用引物D-loop-F（5′-ATACTGATTACG- CTGGTCTTG-3′）和D-loop-R（5′-ACTAATAGAAAGGCTGGGATC-3′）擴(kuò)增mtDNA D-loop區(qū)序列片段。PCR擴(kuò)增體系如下：2×Taq PCR StarMix 25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA樣品2.0 μL，最后用ddH2O補(bǔ)齊至50.0 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min； ?94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察確認(rèn)目的片段后切下膠塊，使用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，純化樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger測序。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

測序結(jié)果使用Chromas 2.6軟件進(jìn)行原始序列峰圖檢測。基于青海駱駝長期存在蒙古駱駝血液滲透的觀點(diǎn)，自NCBI下載了蒙古與內(nèi)蒙古雙峰駝D-loop序列（表2），與青海駱駝測序結(jié)果匯總分析。在MEGA 7.0軟件中使用MUSCLE比對序列同源性并校正，計(jì)算序列的核苷酸組成與遺傳距離；使用DnaSP 5.10軟件對多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)、核苷酸多樣性、單倍型多樣性、單倍型數(shù)、平均核苷酸差異、中性檢驗(yàn)及遺傳分化指數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以野生雙峰駝（wild Bactrian camel，Camelus ferus）D-loop序列NC_009628.2為外群，構(gòu)建鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，并用iTOL網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/）美化；使用Network 4.2軟件繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青海駱駝D-loop序列DNA多態(tài)性分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增，3個(gè)青海駱駝?lì)惾韩@得的D-loop序列片段與預(yù)期目的片段大小（1 300～ ?1 500 bp）一致，且條帶單一（圖1），保證了后續(xù)分析的可靠性。以野生雙峰駝D-loop序列為參考，分別比對3個(gè)青海駱駝?lì)惾簻y序結(jié)果與蒙古、內(nèi)蒙古雙峰駝序列。經(jīng)校正與修剪后，共獲得118條長度為759 bp的D-loop序列（圖2）。

序列中4種堿基（T、C、G和A）的平均含量分別為24.7%、27.9%、28.9%和18.5%，A+T含量（53.6%）高于C+G含量（46.4%），符合mtDNA D-loop區(qū)富含A/T堿基的序列特征。5個(gè)類群共檢測到96個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，整個(gè)群體的核苷酸多樣性、核苷酸平均差異數(shù)和單倍型多樣性分別為0.014 93、10.851和0.845。在3個(gè)青海駱駝?lì)惾褐校继m雙峰駝具有最高的核苷酸多樣性，莫河雙峰駝次之，而德令哈雙峰駝最低。與之對應(yīng)，中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，都蘭和莫河雙峰駝TajimaD結(jié)果均為負(fù)值且顯著偏離中性（P < ?0.05），表明二者在形成進(jìn)程中均發(fā)生過明顯的種群擴(kuò)張，而德令哈雙峰駝群體則較為保守（表3）。

2.2 雙峰駝群體歷史動態(tài)分析

遺傳距離與遺傳分化指數(shù)分析顯示，3個(gè)青海駱駝?lì)惾洪g的遺傳距離較為接近，而都蘭雙峰駝與莫河雙峰駝間的遺傳分化指數(shù)最小，表明二者之間可能發(fā)生一定程度的基因交流（表4）。內(nèi)蒙古雙峰駝與其他4個(gè)類群的遺傳差異均遠(yuǎn)大于蒙古雙峰駝，進(jìn)一步證實(shí)了青海駱駝可能與蒙古雙峰駝而非內(nèi)蒙古雙峰駝存在更為密切的親緣關(guān)系。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析

為了進(jìn)一步分析青海駱駝3個(gè)類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以野生雙峰駝mtDNA D-loop序列為外群構(gòu)建了NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，所有樣本明顯分為兩個(gè)獨(dú)立的分支：第一支分支是青海駱駝3個(gè)類群與蒙古雙峰駝，另一支則是內(nèi)蒙古雙峰駝，兩支在進(jìn)化上存在明顯界限（圖3）。

由表5可知，單倍型分析共界定了27種單倍型Hap1～Hap27。其中：都蘭雙峰駝有7種，德令哈雙峰駝有6種，莫河雙峰駝有9種，蒙古雙峰駝有7種，內(nèi)蒙古雙峰駝有4種。27個(gè)單倍型中，Hap5和Hap8在不同雙峰駝?lì)惾褐谐霈F(xiàn)的頻率最高，在3個(gè)青海駱駝?lì)惾褐芯蟹植肌?/p>

單倍型網(wǎng)絡(luò)分析呈現(xiàn)的不同類群親緣關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果基本一致。內(nèi)蒙古雙峰駝與其他類群之間明顯存在差異，相比之下蒙古雙峰駝與青海駱駝則更為接近。值得關(guān)注的是，青海駱駝3個(gè)類群間存在單倍型共享：Hap6為都蘭和莫河雙峰駝共享；Hap9為都蘭和德令哈雙峰駝共享；Hap5與Hap8則在3個(gè)類群中均有發(fā)現(xiàn)（圖4）。

3 討? 論

厘清品種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與遺傳多樣性是家畜遺傳資源保護(hù)的必要前提。圍繞雙峰駝的研究早期多采用細(xì)胞染色體核型分析與血液蛋白多態(tài)性分析的手段，獲得的信息量有限[8-9]。近年來，借助基因組DNA測序手段與多種分子標(biāo)記的輔助分析，更多的遺傳信息被揭示[10]。程佳等[11]使用線粒體細(xì)胞色素b部分序列檢測了5個(gè)雙峰駝?lì)惾海治霰砻髦袊茵B(yǎng)雙峰駝起源于同一母系，但與現(xiàn)存的野生雙峰駝祖先并不相同。這一結(jié)論隨后也被野生和家養(yǎng)雙峰駝的全基因組測序結(jié)果所證實(shí)[12]。何曉紅等[13]使用微衛(wèi)星引物分析了10個(gè)雙峰駝?lì)惾旱倪z傳關(guān)系，證實(shí)新疆的雙峰駝?lì)惾壕蹫橐活悾嗪！⒏拭C、內(nèi)蒙古與蒙古雙峰駝具有較近的親緣關(guān)系。而另一項(xiàng)針對中國、蒙古與俄羅斯等多國的11個(gè)雙峰駝?lì)惾哼M(jìn)行比較的結(jié)果則證實(shí)，不同地域間的家養(yǎng)雙峰駝?lì)惾悍只卣鞑⒉幻黠@，存在一定的基因交流[14]。

本研究基于遺傳距離與遺傳分化指數(shù)分析進(jìn)一步表明，在家養(yǎng)雙峰駝內(nèi)部依然存在一定程度的遺傳分化，青海駱駝、蒙古雙峰駝與內(nèi)蒙古雙峰駝處于不同的進(jìn)化分支。據(jù)記載，青海駱駝的起源至少有3個(gè)：早期駱駝可能隨吐谷渾人、蒙古人征戰(zhàn)由內(nèi)蒙古帶入青海；解放前部分哈薩克人由新疆帶駝進(jìn)入柴達(dá)木盆地；而解放初期青海由甘肅購進(jìn)數(shù)千峰駱駝屯牧繁育于盆地[15]。本研究進(jìn)一步比較青海駱駝的3個(gè)類群發(fā)現(xiàn)，都蘭雙峰駝與莫河雙峰駝存在相對較多的基因交流，而德令哈雙峰駝顯示出與其他兩個(gè)類群明顯不同的分化方向。研究結(jié)果與先前研究存在一定的差異[13，16]，但與白俊艷等[17]基于表型測定結(jié)果的聚類分析相符，這可能與之前試驗(yàn)采用的樣品數(shù)量、地理區(qū)域與分子標(biāo)記選擇相關(guān)。因此，還需要通過進(jìn)一步研究分析青海駱駝不同起源的可能性。

4 結(jié)? 論

從母源進(jìn)化上看，青海駱駝與蒙古雙峰駝間遺傳分化程度較小，但與內(nèi)蒙古雙峰駝間存在較大的遺傳差異，其起源可能更傾向于蒙古雙峰駝而非內(nèi)蒙古雙峰駝。青海駱駝3個(gè)類群間存在一定的基因交流，但是德令哈雙峰駝表現(xiàn)出與其他兩個(gè)類群間明顯的遺傳分化。研究進(jìn)一步闡明了青海駱駝的遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對于青海駱駝的品種保護(hù)與資源開發(fā)具有指導(dǎo)意義。

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Genetic Diversity of Mitochondrial DNA D-loop Region in Qinghai Camel

Abstract To evaluate the genetic diversity and maternal origin of Qinghai camel，a total of 88 ear tissue samples were collected from three distributed ecotypes of Qinghai camel.Genomic DNA extraction was performed to obtain the samples，after which the D-loop region on mitochondrial DNA was amplified and sequenced，and sequences were compared with those of Mongolian and Inner Mongolian Bactrian camels.The results showed that a total of 96 polymorphic loci were detected in D-loop sequences and 27 haplotypes were identified.There were 16 haplotypes shared by Qinghai camel.The Mongolian Bactrian camel had seven haplotypes，while the Inner Mongolian Bactrian camel had four haplotypes.Phylogenetic analysis revealed two distinct branches.The first branch consisted of three ecotypes of Qinghai camel and Mongolian Bactrian camel，with the Delingha Bactrian camel exhibiting a clear distinction from the other two ecotypes.The second branch was predominantly represented by Inner Mongolian Bactrian camel.The genetic distance between Qinghai camel and Inner Mongolia Bactrian camel was significantly greater than that between Qinghai camel and Mongolia Bactrian camel.In conclusion，the maternal origin of Qinghai camel is more closely related to Mongolian Bactrian camel than to the Inner Mongolian Bactrian camel.

Key words Qaidam Bactrian camel; Mitochondrial DNA; Phylogeny; Genetic diversity; Haplotype