云黃連交配系統驗證

崔 睿 左 婷 張鳳婷 王祎婷

（云南國土資源職業學院 云南昆明 652501）

云黃連，學名云南黃連，又稱云連，為毛莨科黃連屬多年生草本植物[1-2]，是中藥材黃連的原植物之一。黃連具有清熱燥濕、祛火解毒等功效，為常用中藥材，以黃連為原料的中成藥品種已有100 多種。云黃連因其主要藥用有效成分小檗堿含量顯著高于其他黃連，為黃連屬植物中最高，極為珍貴。其市場價格比其他黃連高出2～3 倍，為我國名貴中藥材。

云黃連屬于東喜馬拉雅植物分區的特有植物，主要分布在怒江、獨龍江流域的高黎貢山、碧羅雪山、擔當力卡山，所在緯度為24° N—36°30′ N，海拔2 500～3 400 m[3]，是典型的低緯高山植物。云黃連為云南省道地藥材，多生長于樹腳枯枝落葉堆、濕潤的陡坡或是布滿苔蘚的石縫中。

目前學者對云黃連的研究集中在其主要藥用成分和栽培方面，對于交配系統研究較少[4]。其中，張霽等研究了不同海拔（2 100～2 700 m）下，野生和人工栽培云黃連的生物量、主要有效成分含量及產量，結果表明野生云黃連根莖和根生物量沿海拔梯度呈上升趨勢，但無顯著性差異[5]；和杏妞和喬玉文等對云黃連栽培技術進行了研究，主要包括選地整地、播種和育苗移栽、田間防病蟲害、采收時期和后期加工等方面[6-7]；楊艷娟等對云黃連花部特征、花粉活力和柱頭可授性及繁育系統進行研究，結果表明云黃連花序為多歧聚傘型，花兩性，外有紫紅色苞片，萼片為黃綠色，花粉活力和柱頭可授性均隨著時間的變化先上升后下降[8-9]。基于此，本文對云黃連的交配系統展開驗證。

1 試驗地概況

試驗于2022 年1 月在云南省怒江州貢山縣云黃連基地進行。該地地處海拔2 650 m，植被為常綠闊葉林，全年日照，年平均降水量在2 000 mm 以上，年平均氣溫17 ℃，為顯著低緯高山氣候環境。

2 試驗方法

2.1 雜交指數估算

研究采用Dafni[10]的標準，在試驗地隨機選取云黃連小花20 朵，對其小花直徑和開花狀態進行測量。判斷標準如下：（1）當小花直徑小于1.0 mm時，記為0，1.0～2.0 mm 記為1，2.1～6.0 mm 記為2，大于6.0 mm 記為3；（2）柱頭具有可授性與花藥開裂散粉是否同時，同步成熟或柱頭具有可授性時花藥未開裂記為0，花藥先開裂散粉記為1；（3）雌蕊與雄蕊的空間位置，同一高度記為0，高度不同時記為1。雜交指數（OCI）值為上述3 項結果之和。當OCI=0 時，繁育系統屬于閉花受精型；當OCI=1 時，屬于專性自交型；當OCI=2 時，屬于兼性自交型，存在異交能力；當OCI=3 時，屬于兼性異交型，自交親和，可能需要傳粉者；當OCI≥4 時，屬于異交型，存在無融合生殖，但需要傳粉者。

2.2 花粉-胚珠比估算

選取花藥未開裂的盛花期花朵，隨機選取雌蕊長花型和雄蕊長花型2 種花型的花朵各10 朵，用FAA固定液固定，分別做好標記帶回實驗室。將固定液中的小花依次取出，將花藥用1.0 mol/L HCl 軟化花粉壁，解剖花藥后將花粉分別移入1.5 mL 的離心管中，用蒸餾水定容。在60 ℃水浴鍋中水解15 min，充分震蕩后搖勻，移取2 μL 花粉液于凹面載玻片上，在顯微鏡下觀察并統計花粉數，重復4 次，計算單花花粉粒數。而后將雌蕊置于載玻片上，用解剖針小心挑破子房壁，觀察并統計單花胚珠數。小花花粉粒數與胚珠數之比即為花粉-胚珠比（P/O）。按照Cruden[11]的方法對P/O進行判斷，P/O為2.7～5.4，繁育系統為閉花受精；P/O為18.1～39.0，繁育系統為專性自交；P/O為 31.9～396.0，繁育系統為兼性自交；P/O為244.7～2 588.0，繁育系統為兼性異交；P/O為2 108.0～195 525.0，繁育系統為專性異交。P/O值的降低意味著近交程度的升高，P/O值的升高意味著遠交程度的上升。

2.3 人工套袋傳粉試驗

按照Dafni 描述的方法開展傳粉試驗：（1）判斷自然條件下的傳粉情況。對照組（CK）不作任何處理，使其保持自然狀態。（2）判斷其是否需要傳粉者。自發的自花傳粉，開花前套硫酸紙袋，不另作其他處理。（3）判斷自交是否親和。同株異花傳粉，開花前去除雄蕊，在同株異花間進行人工傳粉，而后套硫酸紙袋。（4）判斷雜交是否親和。人工異株異花傳粉，開花前去除雄蕊后采用其他植株的花粉進行傳粉，而后套硫酸紙袋。（5）檢測孤雌生殖情況。去除雄蕊后套硫酸紙袋，不另作其他處理。（6）判斷結子情況是否受傳粉者影響。風媒的異花傳粉，去除雄蕊后套網袋（能通風通花粉），隔離昆蟲。（7）檢測異花花粉對結子的影響。自然條件下異花傳粉行為，去除雄蕊后不另作其他處理，使其自由傳粉。在花藥散粉之前進行去雄工作，人工授粉時將其他花朵取下，然后直接將其花藥對準待授粉花朵的柱頭，使其充分授粉。在果實完全成熟后，采集種子，然后進行結實率的統計。

3 結果與分析

3.1 雜交指數估算

測量結果顯示，云黃連小花朵直徑為 8.9～18.1 mm，依據Dafni 的標準，其花朵直徑大于6 mm，記數為3；部分云黃連小花雌蕊先成熟，部分雄蕊先成熟，故記為0 或1；雌蕊與雄蕊在空間上分離，記為1。云黃連的OCI 值為4 或5，根據Dafni 的標準，OCI 值與自交率呈反比，OCI 值越大，其異交程度越高，由此判斷云黃連的繁育系統屬于異交型，存在無融合生殖，但需要傳粉者。

3.2 花粉-胚珠比估算

由試驗得出，云黃連中雄蕊長的單花花粉粒數為708 750～1 086 250 粒，平均925 745 粒；單花胚珠數為76～103 枚，平均91 枚；花粉-胚珠比為10 173。雌蕊長的單花花粉粒數為736 250～967 500 粒，平均844 167 粒；單花胚珠數為78～124 枚，平均97 枚；花粉-胚珠比為8 702，結果如表1 所示。根據Cruden的標準，可以得出結論：2 種花型的云黃連的繁育系統都是專性異交。此外，統計學分析表明，雄蕊長花型云黃連的花粉-胚珠比極顯著大于雌蕊長花型（P＜0.01），說明雄蕊長花型遠交程度更高。

表1 云黃連花粉-胚珠比

3.3 套袋傳粉試驗驗證云黃連交配系統

采用人工授粉及套袋試驗驗證云黃連的交配系統，結果如表2 所示。自然條件下云黃連的結實率為89.47%，去除雄蕊套硫酸紙袋的結實率為48.94%，說明云黃連存在孤雌生殖情況，且孤雌生殖比例較高。不去除雄蕊套硫酸紙袋處理，隔絕蟲媒與風媒的自發自花傳粉結實率為59.26%，稍高于孤雌生殖的結實率，而同株異花人工傳粉結實率卻高達83.33%，表明云黃連自交親和，但需要傳粉者，幾乎不存在自發的自花傳粉。在自然界中，昆蟲在同一植株上的訪問存在連續性，因此同株異花傳粉所引起的自交也有可能出現。人工異株異花傳粉結實率為86.49%，這說明云黃連為異花授粉植物。去除雄蕊套網袋處理的結實率為47.17%，與去除雄蕊套硫酸紙袋產生的48.94%無融合生殖比例相近，去除雄蕊不套袋處理結實率高達88.89%，印證了云黃連不存在風媒傳粉，依靠昆蟲來進行傳粉才能確保其較高的結實率。傳粉實驗進一步證實云黃連交配系統為異交型，自交親和，需要傳粉者，其傳粉媒介為蟲媒。

表2 云黃連不同傳粉處理的結實率

4 討論

高山區域由于其惡劣的環境條件，被認為是陸地生態系統中最為極端的生境之一[12-13]。長期以來，高山被認為是研究生物適應進化機制最理想的場所之一。植物繁育系統的研究是研究進化生物學中的重要部分[14]。

隨著海拔的升高，傳粉昆蟲的種類、數量和活動能力明顯下降[15]。傳粉限制是高山異交植物所面臨的普遍問題，且隨著海拔升高限制越嚴重。經雜交指數估算、花粉-胚珠比估算和人工套袋傳粉試驗驗證可知，云黃連交配系統為異交型，自交親和，需要蟲媒傳粉，具有較高的孤雌生殖能力。

5 結語

云黃連由于生長環境日益惡劣等原因，野生資源日益減少，因此開展云黃連交配系統研究，了解其繁殖特性和遺傳多樣性，能夠為保護野生資源和促進人工栽培及引種馴化提供科學依據，還可以為中藥材產業的發展和野生資源的保護提供有力支持。