趨化因子配體25、葉酸受體1在結直腸癌中的表達及與臨床病理特征、預后的關系

王盼，楊秀春

作者單位：北京市平谷區中醫醫院，a普外科，b外科，北京101200

結直腸癌（CRC）的發病率逐年上升［1］。大部分病人確診治療時病情已發展至中晚期階段，錯過最佳治療時機，病人預后效果不理想，且目前臨床缺乏能夠準確評估病人預后的指標，因此，尋找能夠有效評估CRC病人預后的生物學指標具有重要的臨床意義［2-3］。趨化因子配體25（CCL25）可一定程度反應機體炎癥程度，機體內主要參與刺激炎癥分子和免疫細胞分化、增殖和凋亡等生理過程［4］。近年來研究發現，趨化因子表達與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關［5］。CCL25體內主要存在于小腸上皮細胞和胸腺，其表達水平與CRC、非小細胞肺癌和卵巢癌等多種腫瘤疾病發展密切相關［6］。葉酸受體1（FOLR1）是一種膜蛋白，參與調節機體細胞增殖、分化和遷移等生理過程［7］。研究發現FOLR1在多種腫瘤細胞增殖、分化等過程中異常表達，例如卵巢癌、肺癌、肝癌等［8-9］。目前CCL25和FOLR1在CRC發展過程中的研究鮮有報道。本研究對CRC病人CCL25和FOLR1水平與預后的關系進行分析，為臨床中CRC的預后提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2014年10月至2019年8月北京市平谷區中醫醫院接收的CRC病人（70例）為研究對象（實驗組），年齡范圍為46～68歲；以同期到本院體檢的35例健康者的血清樣本作為對照組，年齡范圍為48～65歲。納入標準：（1）臨床確診為CRC；（2）術前未進行抗腫瘤治療；（3）無其他并發癥；（4）病人均知情同意；排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）合并血液相關疾病；（3）合并肝、腎等其他器官障礙者；（4）基礎臨床病理資料不全者。本研究經北京市平谷區中醫醫院倫理委員會審核批準（批號20140825）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集CRC病人癌組織以及癌旁組織（距癌組織＞3 cm）。采集CRC病人術前和對照組體檢時3～5 mL空腹靜脈血，離心（3 500 r/min，10 min，半徑8 cm）后，存儲于-80 ℃。

1.2.2 酶聯免疫吸附法 分別采用人趨化因子配體25（CCL25）ELISA試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司）、葉酸受體1（FOLR1）ELISA試劑盒（上海優科唯生物科技有限公司）檢測血清CCL25和FOLR1表達水平，嚴格按照試劑盒操作說明進行檢測。

1.2.3 免疫組織化學染色法 將組織進行脫蠟、水化、沖洗（PBS緩沖液）后，將抗原進行修復，玻片沖洗（PBS緩沖液，3次）后，依次加入CCL25和FOLR1的一抗，孵育過夜（4 ℃），沖洗（PBS緩沖液，4次）后加入生物素標記的二抗，放置45 min（室溫），沖洗（PBS緩沖液，3次）后進行染色、復染、定色、脫水、封片。陽性病理切片為陽性對照，PBS緩沖液為一抗做陰性對照。

1.2.4 免疫組化結果判定 評分標準分為將著色強度和著色面積兩個部分：（1）著色強度評分：棕褐色（3分）；棕黃色（2分）；淡黃色（1分）；無著色（0分）。（2）著色面積評分：占比＞75%（4分）；占比51%～75%（3分）；占比26%～50%（2分）；占比11%～25%（1分）；占比＜10%（0分）。將兩部分評分相加，評估其陽性表達（≥3分）和陰性表達（＜3分）。

1.2.5 隨訪觀察 對CRC病人進行為期3年的隨訪（電話及門診復查），病人隨訪率為100%。

1.3 統計學方法 通過SPSS 25.0軟件對數據進行分析，計數資料用例（%）描述，進行χ2檢驗，計量資料行描述，進行獨立樣t檢驗（組間）和配對樣本t檢驗（組內），通過Kaplan-Meier法進行生存分析，CRC病人預后的影響因素通過多因素Cox回歸進行評估。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料與血清CCL25、FOLR1的表達分析 相較于對照組，實驗組病人血清CCL25和FOLR1水平較高，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組年齡、性別均差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 CRC病人70例與健康者35例一般資料與血清CCL25、FOLR1的表達水平分析

2.2 CRC組織和癌旁組織CCL25、FOLR1表達比較 通過顯微鏡觀察結果顯示，CRC組織中CCL25的陽性表達率（68.57%比21.43%）高于癌旁組織，CRC組織中FOLR1的陽性表達率（65.71%比25.71%）高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2，圖1。

表2 CRC組織及癌旁組織中CCL25、FOLR1的表達情況/例（%）

圖1 結直腸癌（CRC）組織及癌旁組織中趨化因子配體25（CCL25）、葉酸受體1（FOLR1）的表達（免疫組織化學染色×200）

2.3 CRC病人血清CCL25、FOLR1表達與臨床病理特征的關系分析 選擇病人年齡、腫瘤長徑、瘤體類型、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、浸潤程度等臨床病理特征進行分類，分析其病理特征與血清CCL25、FOLR1表達的關系。結果顯示：CRC病人血清CCL25、FOLR1表達水平與淋巴結轉移、TNM分期、浸潤程度有關（P＜0.05）。見表3。

表3 血清趨化因子配體25（CCL25）、葉酸受體1（FOLR1）的表達與結直腸癌70例臨床病理特征的關系/

表3 血清趨化因子配體25（CCL25）、葉酸受體1（FOLR1）的表達與結直腸癌70例臨床病理特征的關系/

注：CCL25為趨化因子配體25，FOLR1為葉酸受體1。

病理特征年齡＜60歲≥60歲腫瘤長徑＜3 cm≥3 cm瘤體類型潰瘍型隆起型浸潤型TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中、高分化淋巴結轉移無有浸潤程度未出肌層突出肌層例數CCL25/（μg/L）t（F）值1.04 P值0.302 FOLR1/（ng/L）t（F）值1.11 P值0.269 38 32 13.90±3.12 14.74±3.64 549.26±81.63 571.92±88.40 0.740.4651.890.063 34 36 13.94±3.72 14.61±3.90 538.84±85.84 579.24±92.42（0.30）0.742（0.59）0.556 23 18 29 13.88±3.20 14.74±3.35 14.31±3.89 544.48±86.90 560.65±84.69 570.98±89.25 3.96＜0.0013.330.001 37 33 12.59±3.48 16.18±4.11 525.96±86.50 597.37±92.67 0.860.3960.960.341 32 38 13.88±3.14 14.62±3.96 548.95±83.35 568.60±86.94 2.720.0083.060.003 35 35 13.08±3.22 15.48±4.10 529.10±74.55 590.14±91.74 2.950.0043.280.002 31 39 12.59±3.50 15.63±4.82 521.58±78.49 589.86±92.42

2.4 CRC病人血清CCL25、FOLR1表達與病人3年生存率的關系分析 分析CRC病人血清CCL25、FOLR1的表達與病人預后的關系，以CRC病人血清CCL25、FOLR1的平均水平值為臨界點，CCL25≥14.28 μg/L為高表達組（32例），＜14.28 μg/L為低表達組（38例），FOLR1≥559.62 ng/L為高表達組（30例），＜559.62 ng/L為低表達組（40例）。結果顯示CCL25高表達組的3年生存率（31.25%，10/32）低于低表達組（78.95%，30/38），FOLR1高表達組3年生存率（30.00%，9/30）低于低表達組（77.50%，31/40），差異有統計學意義（χ2=4.63、4.61，均P＜0.001）。

2.5 CRC病人預后影響因素的Cox回歸分析 以CRC病人預后（死亡=1，生存=0）為因變量，TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、浸潤程度（未出肌層=0，突出肌層=1）、淋巴結轉移（無=0，有=1）、CCL25（具體值）和FOLR1（具體值）水平為自變量進行多因素Cox回歸。結果顯示，淋巴結轉移、TNM分期、浸潤程度、FOLR1和CCL25水平為CRC病人預后影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 結直腸癌病人預后影響因素的Cox回歸分析

3 討論

CRC是臨床發病率較高的惡性腫瘤之一，其發生發展是一個多階段、多基因的過程［10］。CRC發病原因復雜，存在多種內在和外在因素，例如家族史、慢性炎癥、飲食習慣等［11］。CRC早期發病特征不明顯，病人確診時多數已發展為中晚期，臨床常采用手術、化療和靶向治療等手段進行干預治療，但由于缺乏特異性預后評估指標，CRC病人預后易發生轉移、復發等不良現象，影響病人預后生活質量［12］。因此，尋找CRC預后評估的特異性指標對CRC病人預后生存率提高具有重要意義。

趨化因子是一類由70～100個氨基酸組成，可以趨化特定細胞定向遷移的低分子分泌蛋白［13］。CCL25屬于趨化因子配體一員，為CCR9的唯一配體，多項研究表明CCL25與受體CCR9共同作用對多種腫瘤細胞的增殖和侵襲等具有促進作用［14］。研究發現，趨化因子誘導機體T細胞反應，從而影響腸癌微環境相關因子的分泌，進而導致機體腸道失衡［15］。徐輝等［16］研究趨化因子誘導T細胞對CRC微環境的影響，結果表明，與癌旁組織相比，CRC組織中趨化因子表達差異有統計學意義，趨化因子與CRC細胞浸潤和腸道微生物群顯著相關，趨化因子可刺激T細胞分泌至腫瘤組織，影響CRC病人的治療及預后情況。本研究中，CCL25陽性表達率在CRC組織中較高，實驗組病人血清CCL25表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），血清CCL25表達與TNM分期、淋巴結轉移、浸潤程度有關（P＜0.05），CRC病人血清CCL25低表達病人3年生存率（78.95%）顯著高于高表達病人生存率（31.25%）（P＜0.05），CCL25水平為CRC病人預后影響因素（P＜0.05），提示CCL25表達水平與CRC病人病情發展密切相關，且影響病人預后生存率。

FOLR屬于葉酸受體蛋白，人體葉酸代謝失調會導致機體免疫因子表達異常，引發染色體甲基化異常，與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關［17］。目前，FOLR主要包括FOLR1、FOLR2和FOLR3三種亞型，FOLR1在體內主要存在于細胞外膜，對葉酸存在較高的親和力，通過其表達水平變化調節多種腫瘤細胞的增殖、分化和遷移等［18-19］。本研究中，FOLR1陽性表達率在CRC組織中較高，實驗組病人血清FOLR1表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），血清FOLR1表達與TNM分期、淋巴結轉移、浸潤程度有關（P＜0.05），血清FOLR1低表達病人3年生存率（77.50%）顯著高于高表達病人生存率（30.00%）（P＜0.05），FOLR1水平為CRC病人預后影響因素（P＜0.05），提示FOLR1表達水平與CRC病人病情發展密切相關，且影響病人預后生存率。

綜上所述，CCL25、FOLR1在CRC病人中表達水平上升，并影響CRC病人預后生存率。