長鏈非編碼RNA人類白細胞抗原復合體18通過微RNA-497-5p/細胞周期蛋白E1軸調節彌漫性大B細胞淋巴瘤的增殖、凋亡和侵襲

廖子龍，向國強，陳繪迦

作者單位：恩施土家族苗族自治州中心醫院血液病科，湖北 恩施445000

彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是一種在遺傳發現、治療反應和臨床預后方面具有高度異質性的腫瘤［1］。盡管治療策略的進步，如脂質體多柔比星和利妥昔單抗，大大提高了DLBCL的治療效果，但總體5年生存率仍較低［2］。因此，進一步研究與DLBCL發病機制有關的治療靶點可能會為DLBCL的有效治療提供更多的機會。大量證據顯示，長鏈非編碼RNA（lncRNA）失調與腫瘤的進展密切相關［3］。人類白細胞抗原復合體18（HCG18）是一種新發現的lncRNA，已有研究發現，HCG18在胃癌、咽喉癌中高表達，且可促進腫瘤的進展［4-5］。而HCG18對DLBCL細胞惡性生物學行為的影響尚不清楚。此外，lncRNA可以充當ceRNA通過海綿化miRNA來調節基因表達，進而在許多疾病中發揮關鍵作用［6］。生物信息學分析發現HCG18與微小RNA-497-5p（miR-497-5p）、miR-497-5p與細胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）存在結合位點。相關研究顯示，過表達miR-497-5p可抑制胰腺癌細胞增殖［7］，CCNE1在DLBCL中發揮致癌作用［8］。而HCG18能否通過調控miR-497-5p/CCNE1軸影響DLBCL惡性進展尚不可知。因此，本研究擬從細胞水平上探究HCG18對DLBCL細胞行為的影響以及對應的分子機制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本及細胞 以2018年5月至2021年5月恩施土家族苗族自治州中心醫院收集的23例DLBCL病人淋巴組織以及同期本院收治的23例良性淋巴結增生病人的淋巴組織為研究對象。病人或其近親屬已知情同意，本實驗符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》要求。

人正常B細胞永生化細胞HMy2.CIR、DLBCL細胞系SU-DHL-1、OCI-LY8、U2932均購自上海烜雅生物公司。

1.2 主要試劑 CCK-8試劑盒購自杭州昊鑫生物公司（貨號HY-K0301），Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒購自沈陽萬類生物公司（貨號WLA001），兔源一抗CCNE1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、增殖細胞核抗原（PCNA）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）及羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司（貨號ab33911、ab32503、ab29、ab8245、ab76003、ab6721）。

1.3 實驗分組 將HMy2.CIR、OCI-LY8、SU-DHL-1、U2932細胞在RPMI 1640培養基中培養。取對數生長期的OCI-LY8細胞，分別將過表達物陰性對照（pcDNA）、HCG18過表達物（pcDNA-HCG18）、小干擾RNA陰性對照（si-NC）、HCG18小干擾RNA（si-HCG18）、si-HCG18和抑制物陰性對照（inhibitorNC）、si-HCG18和miR-497-5p 抑制物（miR-497-5p inhibitor）轉染于OCI-LY8細胞，并分組為pcDNA組、pcDNA-HCG18組、si-NC組、si-HCG18組、si-HCG18+inhibitorNC組、si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組。另取正常培養的OCI-LY8細胞作為Ct組。轉染48 h后收集各組細胞進行實驗。

1.4 qRT-PCR檢測HCG18、miR-497-5p表達TRIzol試劑提取總RNA，總RNA反轉錄為cDNA后進行PCR反應。通過2-ΔΔCt法分別以GAPDH、U6為內參計算HCG18、miR-497-5p相對表達量。引物為GAPDH正向5＇-AAAGGGTCATCATCTCTG-3＇，反向5＇-GCTGTTGTCATACTTCTC-3＇，HCG18正向5＇-GCTAGGTCCTCTACTTTCTG-3＇，反向5＇-CAGAAAGTAGAGGACCTAGC-3＇，miR-497-5p正向5'-CCTTCA GCAGCACACTGTGG-3'，反向5'-CAGTGCAGGGTC CGAGGTAT-3'，U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 細胞增殖的檢測 將細胞接種在96孔板（1×104個/孔）中，并在37 ℃、5%二氧化碳下培養48 h。然后，去除上清液，使用無血清新鮮培養基以10∶1的比例稀釋CCK-8溶液。各孔加入100 μL CCK-8溶液孵育1 h后測量450 nm處的吸光度［D（λ）450nm］。

1.6 細胞凋亡的檢測 調節細胞濃度至7×104個/毫升。然后用500 μL結合緩沖液、5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI重懸細胞。在4 ℃下避光孵育15 min，觀察細胞凋亡。

1.7 細胞侵襲的檢測 將細胞稀釋至2×105個/毫升并懸浮到預涂有基質膠的上室中，再向下室加入含12%胎牛血清的RPMI 1640培養基。孵育24 h后，用多聚甲醛固定、0.1%結晶紫染色侵襲的細胞，觀察并統計細胞侵襲數。

1.8 PCNA、CCNE1、Bax、MMP-9蛋白的檢測RIPA緩沖液提取蛋白。取30 μg蛋白經定量、電泳、轉模、封閉處理后，將膜在4 ℃下與一抗PCNA（1∶5 000）、CCNE1（1∶4 000）、Bax（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）、MMP-9（1∶2 000）過夜孵育，再與二抗（1∶5 000）孵育1.5 h。加入ECL觀察蛋白印跡，Image J軟件統計蛋白表達情況。

1.9 靶向關系驗證 分別構建HCG18、CCNE1野生型質粒和突變型質粒，并命名為HCG18-WT、CCNE1-WT、HCG18-MUT、CCNE1-MUT，將HCG18-MUT、HCG18-WT、CCNE1-MUT、CCNE1-WT分別與miR-497-5pmimic或mimic NC共轉染于OCI-LY8細胞，48 h后，評估螢光素酶活性變化。

1.10 統計學方法 SPSS 29.0軟件用于統計分析，以表示數據。獨立樣本t檢驗用于兩組間比較，單因素方差分析及事后SNK-q檢驗用于多組間的比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCG18、miR-497-5p表達及CCNE1蛋白表達比較 與良性淋巴結增生病人淋巴組織比較，DLBCL淋巴組織中HCG18、CCNE1蛋白表達升高，miR-497-5p表達降低（P＜0.05），見圖1，表1。與HMy2.CIR細胞相比，SU-DHL-1、OCI-LY8、U2932細胞中HCG18表達及CCNE1蛋白表達上調，miR-497-5p表達下調，且HCG18表達及CCNE1蛋白表達量最高，以及miR-497-5p表達量最低的細胞是OCI-LY8細胞，因此，選取OCI-LY8細胞進行轉染實驗，見圖2，表2。

表1 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在淋巴組織中的表達/

表1 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在淋巴組織中的表達/

注：DLBCL為彌漫性大B細胞淋巴瘤，HCG18為人類白細胞抗原復合體18，miR-497-5p為微RNA-497-5p，CCNE1為細胞周期蛋白E1，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

CCNE1/GAPDH 0.23±0.02 1.45±0.14組別良性淋巴結增生病人淋巴組織DLBCL淋巴組織例數23 23 HCG18 1.00±0.00 2.36±0.15 miR-497-5p 1.00±0.00 0.18±0.02 41.37＜0.001 t值P值43.48＜0.001 196.63＜0.001

表2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細胞中的表達/

表2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細胞中的表達/

注：HCG18為人類白細胞抗原復合體18，miR-497-5p為微RNA-497-5p，CCNE1為細胞周期蛋白E1，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。①與HMy2.CIR細胞比較，P＜0.05。

CCNE1/GAPDH 0.29±0.02 1.42±0.13①1.08±0.09①0.87±0.07①178.20＜0.001組別HMy2.CIR細胞OCI-LY8細胞SU-DHL-1細胞U2932細胞F值P值例數6 6 6 6 HCG18 1.00±0.00 2.66±0.24①2.01±0.14①1.72±0.09①133.30＜0.001 miR-497-5p 1.00±0.00 0.17±0.01①0.39±0.02①0.56±0.05①989.30＜0.001

圖1 蛋白質印跡法檢測淋巴組織中CCNE1蛋白表達

圖2 蛋白質印跡法檢測OCI-LY8細胞中CCNE1蛋白表達

2.2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細胞中的表達 與Ct組和pcDNA組對比，pcDNAHCG18組HCG18表達及CCNE1蛋白表達上調，miR-497-5p表達下調（P＜0.05），與si-NC組、Ct組相比，si-HCG18組HCG18、CCNE1蛋白表達下調，miR-497-5p表達上調（P＜0.05），與si-HCG18+inhibitor NC組、si-HCG18組相比，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組miR-497-5p表達下調，CCNE1蛋白表達上調（P＜0.05），見圖3，表3。

表3 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細胞中的表達/

表3 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8細胞中的表達/

注：HCG18為人類白細胞抗原復合體18，miR-497-5p為微RNA-497-5p，CCNE1為細胞周期蛋白E1，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Ct為對照，pcDNA為過表達物陰性對照，pcDNA-HCG18為HCG18過表達物，si-NC為小干擾RNA陰性對照，si-HCG18為HCG18小干擾RNA，inhibitorNC為抑制物陰性對照，miR-497-5p inhibitor為miR-497-5p 抑制物。①與Ct組對比，P＜0.05。②與pcDNA組對比，P＜0.05。③與si-NC組對比，P＜0.05。④與si-HCG18組對比，P＜0.05。⑤與si-HCG18+inhibitorNC組對比，P＜0.05。

2.33±0.21①②1.44±0.19 0.45±0.03①③0.44±0.04 0.87±0.08④⑤127.80＜0.001 pcDNA-HCG18組si-NC組si-HCG18組si-HCG18+inhibitorNC組si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組F值P值6 6 6 6 6 1.96±0.23①②1.01±0.01 0.26±0.03①③0.25±0.02 0.26±0.03 298.80＜0.001 0.28±0.02①②1.03±0.02 1.95±0.14①③1.94±0.13 1.21±0.09④⑤314.50＜0.001

圖3 蛋白質印跡法檢測OCI-LY8細胞中CCNE1蛋白表達

2.3 過表達或沉默HCG18對OCI-LY8細胞增殖的影響 與Ct組和pcDNA組對比，pcDNA-HCG18組OCI-LY8細胞D（λ）450nm值升高（P＜0.05），與Ct組、si-NC組比較，si-HCG18組OCI-LY8細胞D（λ）450nm值降低（P＜0.05），與si-HCG18組、si-HCG18+inhibitor NC組比較，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組OCILY8細胞D（λ）450nm值升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組OCI-LY8細胞增殖、凋亡、侵襲情況比較/

表4 各組OCI-LY8細胞增殖、凋亡、侵襲情況比較/

注：D（λ）450 nm為OCI-LY8細胞450 nm處吸光度，Ct為對照，pcDNA為過表達物陰性對照，pcDNA-HCG18為HCG18過表達物，si-NC為小干擾RNA陰性對照，si-HCG18為HCG18小干擾RNA，inhibitorNC為抑制物陰性對照，miR-497-5p inhibitor為miR-497-5p 抑制物。①與Ct組對比，P＜0.05。②與pcDNA組對比，P＜0.05。③與si-NC組對比，P＜0.05。④與si-HCG18組對比，P＜0.05。⑤與si-HCG18+inhibitorNC組對比，P＜0.05。

侵襲細胞數目/個68.85±5.67 70.23±5.62 115.58±8.42①②69.63±5.72 28.31±2.44①③27.31±2.35 46.65±3.22④⑤207.56＜0.001分組Ct組pcDNA組pcDNA-HCG18組si-NC組si-HCG18組si-HCG18+inhibitorNC組si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組F值P值例數6 6 6 6 6 6 6 D（λ）450 nm值1.06±0.12 1.08±0.11 1.98±0.15①②1.07±0.10 0.36±0.04①③0.34±0.03 0.79±0.07④⑤195.00＜0.001細胞凋亡率/%18.38±1.62 18.46±1.56 9.45±0.28①②18.56±1.66 43.67±3.25①③44.18±3.37 25.58±2.24④⑤44.91＜0.001

2.4 過表達或沉默HCG18對OCI-LY8細胞凋亡的影響 與Ct組、pcDNA組比較，pcDNA-HCG18組OCI-LY8細胞凋亡率降低（P＜0.05），與Ct組、si-NC組比較，si-HCG18組OCI-LY8細胞凋亡率上升（P＜0.05），與si-HCG18+inhibitor NC組、si-HCG18組相比，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組OCI-LY8細胞凋亡率下降（P＜0.05），見圖4，表4。

圖4 流式細胞術檢測OCI-LY8細胞凋亡

2.5 過表達或沉默HCG18影響OCI-LY8細胞侵襲與pcDNA組、Ct組相比，pcDNA-HCG18組OCI-LY8細胞侵襲數目升高（P＜0.05），與Ct組、si-NC組比較，si-HCG18組OCI-LY8細胞侵襲數目降低（P＜0.05），與si-HCG18組、si-HCG18+inhibitor NC組比較，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組OCI-LY8細胞侵襲數目升高（P＜0.05），見圖5，表4。

圖5 Transwell實驗檢測OCI-LY8細胞侵襲（結晶紫染色×200）

2.6 過表達或沉默HCG18影響OCI-LY8細胞中蛋白表達 與Ct組和pcDNA組對比，pcDNAHCG18組OCI-LY8細胞中PCNA、MMP-9蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低（P＜0.05），與Ct組和si-NC組對比，si-HCG18組PCNA和MMP-9蛋白表達下調，Bax蛋白表達上調（P＜0.05），與si-HCG18組、si-HCG18+inhibitor NC組比較，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組PCNA和MMP-9蛋白表達上調，Bax蛋白表達下調（P＜0.05），見圖6，表5。

表5 各組OCI-LY8細胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表達比較/

表5 各組OCI-LY8細胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表達比較/

注：Bax為Bcl-2相關X蛋白，PCNA為增殖細胞核抗原，MMP-9為基質金屬蛋白酶9，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Ct為對照，pcDNA為過表達物陰性對照，pcDNA-HCG18為HCG18過表達物，si-NC為小干擾RNA陰性對照，si-HCG18為HCG18小干擾RNA，inhibitorNC為抑制物陰性對照，miR-497-5p inhibitor為miR-497-5p抑制物。①與Ct組對比，P＜0.05。②與pcDNA組對比，P＜0.05。③與si-NC組對比，P＜0.05。④與si-HCG18組對比，P＜0.05。⑤與si-HCG18+inhibitorNC組對比，P＜0.05。

PCNA/GAPDH 0.71±0.07 0.72±0.06 1.39±0.13①②0.73±0.06 0.22±0.03①③0.23±0.02 Bax/GAPDH 0.35±0.02 0.36±0.03 0.17±0.01①②0.34±0.03 0.94±0.09①③0.95±0.08 MMP-9/GAPDH 0.92±0.07 0.93±0.08 1.72±0.16①②0.94±0.06 0.31±0.02①③0.32±0.03 0.71±0.07④⑤204.90＜0.001分組Ct組pcDNA組pcDNA-HCG18組si-NC組si-HCG18組si-HCG18+inhibitor NC組si-HCG18+miR-497-5p inhibitor組F值P值例數6 6 6 6 6 6 6 0.54±0.05④⑤199.73＜0.001 0.57±0.05④⑤207.81＜0.001

圖6 蛋白質印跡法檢測OCI-LY8細胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表達

2.7 HCG18靶向調控miR-497-5p/CCNE1軸lncRNA HCG18與miR-497-5p、miR-497-5p與CCNE1存在結合位點，見圖7。miR-497-5p mimic和HCG18-WT共轉染組的螢光素酶活性低于mimic NC和HCG18-WT共轉染組（P＜0.05）。miR-497-5p mimic和CCNE1-WT共轉染組的螢光素酶活性低于mimic NC和CCNE1-WT共轉染組（P＜0.05），見表6。

表6 各組螢光素酶活性比較/

表6 各組螢光素酶活性比較/

注：mimic NC為模擬物陰性對照，miR-497-5p mimic為微RNA-497-5p模擬物，HCG18-WT為人類白細胞抗原復合體18野生型質粒，HCG18-MUT為人類白細胞抗原復合體18突變型質粒，CCNE1-WT為細胞周期蛋白E1野生型質粒，CCNE1-MUT為細胞周期蛋白E1突變型質粒。

CCNE1-MUT 1.01±0.13 1.00±0.11 0.14 0.888組別mimic NC組miR-497-5p mimic組t值P值例數6 6 HCG18-WT 1.02±0.10 0.26±0.02 18.26＜0.001 HCG18-MUT 1.03±0.14 1.05±0.16 0.23 0.822 CCNE1-WT 1.06±0.17 0.22±0.03 11.92＜0.001

圖7 長鏈非編碼RNA人類白細胞抗原復合體18（lncRNA HCG18）與微RNA-497-5p（miR-497-5p）、miR-497-5p與細胞周期蛋白E1（CCNE1）的結合位點圖

3 討論

最近，越來越多的研究開始關注一系列在DLBCL進展中發揮基本生物學作用的lncRNA。如lnc SMAD5-AS1過表達可以通過海綿化miR-135b-5p上調APC表達來抑制體外和體內DLBCL增殖［9］，lncRNA FIRRE通過促進DLBCL中的細胞增殖和減少細胞凋亡而發揮癌基因的作用［10］。此外，各種研究已將HCG18與腫瘤進展聯系起來。如HCG18在透明細胞腎細胞癌組織和細胞中高表達，沉默HCG18減弱了透明細胞腎細胞癌細胞活力、遷移和侵襲能力［11］，HCG18可促進肺腺癌中的腫瘤生長［12］。這些結果揭示了HCG18在上述腫瘤中的促癌作用。本研究表明，在DLBCL淋巴組織和DLBCL細胞中HCG18上調表達，并選擇了HCG18上調表達最高的OCI-LY8細胞進行后續實驗。PCNA是一種重要的復制輔助因子，具有促進細胞增殖的作用［13］，Bax作為一種細胞凋亡調節劑，其缺失會阻止細胞快速凋亡［14］，MMP-9被認為是腫瘤侵襲過程中細胞外基質蛋白水解降解的主要因素［15］。本研究顯示，過表達HCG18可促進OCI-LY8細胞中PCNA、MMP-9蛋白表達及細胞增殖、侵襲，抑制Bax蛋白表達及細胞凋亡，而沉默HCG18則影響效果呈相反趨勢。提示HCG18在DLBCL中具有致癌作用，沉默HCG18可抑制OCI-LY8細胞增殖、侵襲，促進細胞凋亡。說明HCG18參與調控DLBCL細胞的增殖、凋亡和侵襲。

大量研究證實，lncRNA可以作為miRNA海綿并調控靶 miRNA的表達［16］。本研究通過生物信息學分析及雙螢光素酶驗證實驗證實了miR-497-5p可與HCG18靶向結合。相關研究表明，過表達miR-497-5p可抑制肺鱗狀細胞癌進展［17］，下調miR-497-5p促進了肝癌細胞的增殖、侵襲［18］。本研究發現，miR-497-5p在DLBCL組織和細胞中下調表達，過表達HCG18抑制了OCI-LY8細胞中miR-497-5p表達，下調HCG18促進了OCI-LY8細胞中miR-497-5p表達，猜想沉默HCG18抑制OCI-LY8細胞增殖、侵襲，促進細胞凋亡可能是通過上調miR-497-5p表達來實現的。為了驗證該假設，本研究在沉默HCG18的同時再用miR-497-5p inhibitor處理OCI-LY8細胞，結果發現，miR-497-5p inhibitor逆轉了沉默HCG18對OCI-LY8細胞增殖、侵襲、凋亡的影響。證明了猜想的正確性。間接證實了HCG18靶向miR-497-5p在DLBCL細胞的增殖、凋亡、侵襲中發揮調節作用。

miRNA可通過與mRNA的3'UTR互補結合來降解mRNA或抑制蛋白質翻譯［19］。為了進一步探究相應的分子機制，本研究通過starbase數據庫發現CCNE1為miR-497-5p的靶基因。據報道，過表達CCNE1與卵巢癌的不良預后相關［20］，上調CCNE1表達可促進結腸癌細胞增殖、侵襲［21］。表明CCNE1在上述腫瘤中發揮著癌基因的作用。本研究顯示，在DLBCL淋巴組織和細胞中CCNE1蛋白上調表達，上調HCG18抑制了OCI-LY8細胞中miR-497-5p表達，促進了CCNE1蛋白表達，而沉默HCG18后則呈相反趨勢，且miR-497-5p與CCNE1存在靶向調控關系，證實了沉默HCG18可能通過上調miR-497-5p來抑制CCNE1表達，進而抑制OCI-LY8細胞增殖、侵襲，促進細胞凋亡。闡明HCG18可通過miR-497-5p/CCNE1軸對DLBCL細胞的增殖、凋亡、侵襲起調節作用。

綜上所述，沉默HCG18抑制OCI-LY8細胞增殖、侵襲，誘導細胞凋亡可能是通過調控miR-497-5p/CCNE1軸實現的。該研究可能為DLBCL的治療提供新的靶點。