非酒精性脂肪性肝病病人血清長鏈非編碼RNA人類白細胞抗原復合體18水平與氧化應激指標、肝纖維化程度的相關性

符鑫，劉悅，彭鑫，黃婷婷，廖雪霞，張曼

作者單位：1儋州市人民醫院消化內科，海南 儋州571799；2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院消化腫瘤外科，湖北 武漢430023

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在沒有已知因素（如飲酒或使用致脂肪藥物）誘導干細胞中脂質積累的情況下出現的肝細胞中脂肪積累量超過5%［1］，與胰島素抵抗及遺傳易感因素密切相關，隨著時間的推移可演變成肝硬化甚至肝癌［2］。研究證實，肝纖維化和氧化應激在NAFLD疾病進展過程中發揮著重要作用［1，3］。已知長鏈非編碼RNA人類白細胞抗原復合體18（lncRNA HCG18）在肝癌組織中呈現高表達，能夠促進癌細胞的增殖及遷移［4］，Xia等［5］學者研究發現lncRNA HCG18在NAFLD病人血清中表達升高，并與胰島素抵抗相關，對NAFLD具有較高的診斷價值。但關于lncRNA HCG18與NAFLD病人氧化應激及肝纖維化程度的研究尚未見報道。本研究通過對92例NAFLD病人與90例健康體檢志愿者進行對比研究，探討血清lncRNA HCG18與氧化應激指標及肝纖維化程度的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以儋州市人民醫院2020年11月至2022年3月收治的92例NAFLD病人為NAFLD組，另選取同期健康體檢志愿者90例為對照組。NAFLD組中男性44例，女性48例，年齡范圍40～78歲，年齡（58.25±8.48）歲，身體質量指數（BMI）為（25.70±2.35）kg/m2；對照組中男性41例，女性49例；年齡范圍42～77歲，年齡（59.20±8.84）歲，BMI為（25.46±2.23）kg/m2。

納入標準：（1）NAFLD組病人符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018更新版）》中NAFLD相關診斷標準［6］；（2）對照組體檢結果顯示肝功能正常；（3）認知功能正常，依從性好。排除標準：（1）合并糖尿病病人；（2）合并其他肝病病人；（3）合并惡性腫瘤病人；（4）有過量飲酒史病人；（5）自身免疫病病人。兩組受試者對研究內容知情并簽署書面同意書。本研究經儋州市人民醫院醫學倫理委員會批準（批號20220518）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 病人入院后，收集一般資料，包括性別、年齡、BMI；檢測病人生化指標，包括血小板計數（PLT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS），計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.2.2 血液樣本收集 NAFLD組病人于入院次日清晨采集空腹靜脈血10 mL，對照組于體檢當日空腹狀態下采集靜脈血10 mL，離心分離血清，-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2.3 血清lncRNA HCG18水平測定 嚴格按照Trizol試劑盒（賽默飛世爾科技公司，貨號15596026）說明書操作，分別提取NAFLD組及對照組血清中總RNA，使用反轉錄試劑盒（日本Takara公司，貨號RRO47AA）反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，采用qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號CFX384）檢測血清lncRNA HCG18相對表達水平（PCR反應體系20 μL：cDNA模板1 μL、雙蒸水7μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、2×Taq PCR master mix 10 μL），條件為95 ℃初始變性45 s；然后在95 ℃變性15 s，55 ℃退火1 min，35個循環。使用2-ΔΔCt方法分析血清lncRNA HCG18表達水平。以GAPDH為內參基因，引物由北京百瑞極生物科技有限公司提供，引物序列如下：lncRNA HCG18正向5'-ATCCTGCCAATAGATGCTGCTCAC-3'，反向5'-AGCCACCTTGGTCTCCAGTCTC-3'；GAPDH正向5'-TGACGTGCCGCCTGGAGAAAC-3'，反向5'-CCGGCATCGAAGGTGGAAGAG-3'。

1.2.4 血清氧化應激指標測定 采用酶聯免疫（ELISA）法檢測血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）水平，試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2.5 NAFLD肝纖維化（NFS）評分［7］NFS=-1.675+0.037×年齡（歲）+0.094×BMI+1.13×FPG受損/糖尿病（是=1，否=0）+0.99×AST/ALT（率）-0.013×PLT（×109/L）-0.66×ALB（g/dL）。NFS＜-1.455為排除晚期纖維化組（30例），-1.455～0.676為中間狀態組（46例），NFS＞0.676為晚期纖維化組（16例）。

1.3 統計學方法 本研究中所有數據采用SPSS 25.0進行分析。計量資料符合正態分布，采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；三組間差異比較采用單因素方差分析檢驗，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；性別等計數資料以例（%）表示，并進行χ2檢驗比較；Pearson相關性分析血清lncRNA HCG18與GSH-Px、丙二醛、SOD的關系；Spearman相關性分析血清lncRNA HCG18與NFS評分的關系；受試者操作特征（ROC）曲線評價血清lncRNA HCG18表達水平對NAFLD的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料對比 兩組性別、年齡、BMI、ALB、TC比較差異無統計學意義（P＞0.05），PLT、AST、ALT、GGT、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、FINS、HOMA-IR比較差異有統計學意義（P＜0.001）。見表1。

表1 健康體檢志愿者90例與NAFLD 92例一般資料比較

2.2 兩組血清lncRNA HCG18與氧化應激指標水平比較 NAFLD組lncRNA HCG18、丙二醛水平明顯高于對照組（P＜0.001），GSH-Px、SOD水平明顯低于對照組（P＜0.001）。見表2。

表2 健康體檢志愿者90例與非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）92例血清lncRNA HCG18與氧化應激指標水平比較/

表2 健康體檢志愿者90例與非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）92例血清lncRNA HCG18與氧化應激指標水平比較/

注：lncRNA HCG18為長鏈非編碼RNA人類白細胞抗原復合體18，GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶。

SOD/（U/mL）92.84±12.89 68.36±10.65 13.98＜0.001組別對照組NAFLD組t值P值例數90 92 lncRNA HCG18 1.01±0.24 1.37±0.29 9.11＜0.001 GSH-Px/（U/mL）98.25±13.92 72.39±11.26 13.79＜0.001丙二醛/（μmol/L）4.17±1.04 6.96±2.13 11.19＜0.001

2.3 不同肝纖維化程度組一般資料對比 三組年齡、BMI、PLT、AST、ALT、GGT、FINS、HOMA-IR比較差異顯著（P＜0.05）。排除晚期纖維化組、中間狀態組、晚期纖維化組年齡、BMI、AST、ALT、GGT、HOMA-IR依次顯著升高（P＜0.001），FINS依次顯著升高（P＜0.05），PLT依次顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）92例不同肝纖維化程度組一般資料對比

2.4 不同肝纖維化程度組血清lncRNA HCG18與氧化應激指標水平比較 排除晚期纖維化組、中間狀態組、晚期纖維化組lncRNA HCG18、丙二醛水平依次顯著升高（P＜0.001），GSH-Px、SOD水平依次顯著降低（P＜0.001）。見表4。

表4 非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）92例不同肝纖維化程度組血清lncRNA HCG18與氧化應激指標水平比較/

表4 非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）92例不同肝纖維化程度組血清lncRNA HCG18與氧化應激指標水平比較/

注：lncRNA HCG18為長鏈非編碼RNA人類白細胞抗原復合體18，GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶。①與排除晚期纖維化組比較，P＜0.05。②與中間狀態組比較，P＜0.05。

SOD/（U/mL）81.45±12.52 66.52±10.25①49.13±8.29①②48.42＜0.001組別排除晚期纖維化組例數3 0中間狀態組46晚期纖維化組F值P值16 lncRNA HCG18 1.20±0.25 1.39±0.30①1.65±0.35①②12.36＜0.001 GSH-Px/（U/mL）81.56±13.58 71.74±10.52①57.06±9.05①②24.27＜0.001丙二醛/（μmol/L）5.64±1.88 7.12±2.16①8.99±2.51①②13.06＜0.001

2.5 NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與氧化應激指標、肝纖維化程度的相關性 Pearson相關性分析顯示，NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與丙二醛呈正相關（r=0.59，P＜0.001），與GSH-Px、SOD均呈負相關（r=-0.57、-0.62，P＜0.001）；Spearman相關性分析顯示NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與NFS評分呈正相關（r=0.69，P＜0.001）。

2.6 血清lncRNA HCG18對NAFLD診斷價值分析 ROC曲線結果顯示，血清lncRNA HCG18診斷NAFLD的曲線下面積（AUC）95%CI為0.85（0.79，0.90），截斷值為1.24，靈敏度為72.8%，特異度為86.7%，約登指數為0.60。

3 討論

據估計，NAFLD患病人數約占全球人口的25%，已成為全球慢性肝病的常見病因［8-9］，中國NAFLD患病率高達25%，年增長率高達0.60%，是NAFLD患病率增長最快的國家［10］。由于NAFLD的發病并無典型癥狀，往往發現時已是晚期［2］，容易有肝硬化、肝衰竭、肝細胞肝癌等肝臟相關疾病，嚴重者因此死亡。因此，尋找能夠早期診斷NAFLD的生物標志物，能夠幫助臨床采取有效干預措施，改善病人預后，具有重大的現實意義。

NAFLD發病較為復雜，目前已知其與胰島素抵抗有關［11］。NAFLD病人由于肝臟受損，ALT、AST、GGT進入血液循環，病人體內三者含量明顯升高，ALT、AST、GGT是診斷肝臟疾病的重要指標，能夠反應肝臟病變嚴重程度［12］。本研究中，NAFLD組HOMA-IR、ALT、AST、GGT顯著高于對照組，排除晚期纖維化組、中間狀態組、晚期纖維化組病人HOMA-IR、ALT、AST、GGT依次顯著升高。NAFLD病人體內的過量氧與清除過量氧的抗氧化系統的失衡是氧化應激產生的主要原因。病人體內過量氧自由基與不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，導致其代謝產物丙二醛增加［3］，由于過量氧自由基的存在，GSH-Px、SOD作為抗氧化酶發揮其抗氧化作用被大量消耗，機體抗氧化能力降低［13］。NAFLD的進展過程中往往伴隨著肝纖維化，Angulo等［7］創建的NAFLD肝纖維化評分（NFS）系統能夠證明肝纖維化程度，并可用于判定NAFLD病人的預后［14］。

lncRNA HCG18是一種具有腫瘤促進作用的lncRNA，在上皮性卵巢癌［15］、乳腺癌［16］中均呈現過表達。在肝細胞癌病人癌組織中，lncRNA HCG18表達升高，并可通過靶向miR-214-3p加速腫瘤進展［4］。本研究中，NAFLD組血清lncRNA HCG18表達水平顯著高于對照組，這與Xia等［5］學者的研究結果具有一致性，表明lncRNA HCG18參與肝功能障礙的進展。lncRNA HCG18在NAFLD中可能是通過負向調控miR-197-3p，增加IL-18的表達參與NAFLD的病情進展［5］，IL-18產生的IFN-γ能夠強烈誘導大鼠脂肪肝的發展［17］。排除晚期纖維化組、中間狀態組、晚期纖維化組血清lncRNA HCG18依次升高。推測NAFLD病人肝纖維化程度越嚴重，lncRNA HCG18水平越高，IL-18水平越高，對肝細胞的損傷程度越嚴重。

NAFLD組血清丙二醛水平明顯高于對照組，GSH-Px、SOD水平明顯低于對照組，這與王永斌等［18］、謝文秀等［19］的研究結果一致。排除晚期纖維化組、中間狀態組、晚期纖維化組丙二醛水平依次顯著升高，GSH-Px、SOD水平依次顯著降低。結果表明，纖維化程度越嚴重，lncRNA HCG18水平越高，機體氧-抗氧化系統失衡越嚴重，氧化應激反應越劇烈。Pearson相關性分析顯示，NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與丙二醛呈正相關，與GSH-Px、SOD均呈負相關；Spearman相關性分析顯示NAFLD組血清lncRNA HCG18水平與NFS評分呈正相關，提示NAFLD病人血清lncRNA HCG18水平與氧化應激指標及肝纖維化程度關系密切。ROC曲線結果顯示，血清lncRNA HCG18對NAFLD具有一定的診斷價值。

綜上所述，NAFLD病人血清lncRNA HCG18表達水平升高，與氧化應激指標及肝纖維化程度存在一定的相關性，且對NAFLD具有一定的診斷價值，可作為NAFLD的生物標志物。但本研究所納入樣本數量較少，且并未對lncRNA HCG18的具體作用機制進行研究，同時由于所納入的受試對象存在個體差異，試驗數據可能存在一定的偏頗。同時僅對lncRNA HCG18一個指標進行了監測，未結合其他相關指標，也是本研究的不足之處，后續需擴大樣本數量，結合其他相關指標，開展細胞實驗或動物實驗等基礎研究進行更加深入的探討。