YTH結構域家族蛋白2和叉頭蛋白轉錄因子3在肺腺癌中的表達關系研究

楊睿，李占江，陳騰飛

作者單位：鄭州大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，河南 鄭州450000

肺癌是世界范圍內發病率最高的惡性腫瘤［1］，其中非小細胞腺癌是最常見的類型，已進入個體化治療時期［2］。但病人3年總生存率仍然較低。叉頭蛋白轉錄因子3（FOXO3），主要參與細胞的生長、增殖、分化和轉化等過程［3］。FOXO3基因表達在癌組織中下調，常被稱為腫瘤抑制器［4］。YTH結構域家族蛋白2（YTHDF2）作為RNA甲基化的閱讀器蛋白，在腫瘤發展中起到重要作用［5］。但在肺癌中的表達及其對肺腺癌的影響目前報道尚少。因此，本研究主要分析YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中的表達，及與病人臨床病理特征和累積生存率的影響，以期為肺腺癌的預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年5月鄭州大學第一附屬醫院行手術治療的肺腺癌病人癌組織及對應的癌旁組織（距離癌組織5 cm以上）80對，其中男52例，女28例。納入標準：原發性肺腺癌；臨床及病理資料完整。排除標準：拒絕參加此次調查研究者；隨訪時間少于1個月者；有精神疾病史病人；其他部位腫瘤及心、腦、肝、腎等嚴重疾病病人。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 生物學分析 采用Ualcan網站，使用其中的癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫對YTHDF2、FOXO3基因的表達分析、生存預后，并進行可視化。

1.2.2 免疫組織化學檢測 按照常規取材肺腺癌組織標本及癌旁正常組織標本，使用免疫組織化學試劑盒（北京博奧派克生物科技有限公司）進行染色，具體操作按照說明書進行。

1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 強度評分：未染色：0分；略染色：1分；明顯染色：2分；深棕色：3分。陽性細胞數比例：隨機觀察不少于5個視野，計數500個細胞中染色陽性細胞數，陽性細胞數目＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，≥50%為3分。強度評分×陽性細胞數比例為染色評分，根據評分結果分為兩組：分數＜4即為低表達、分數≥4即為高表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.2軟件進行統計學分析。陽性細胞數目為計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 YTHDF2及FOXO3在肺腺癌中及癌旁正常組織中的表達差異 比較TCGA數據庫中515例肺腺癌組織和59例癌旁正常組織中YTHDF2、FOXO3基因的表達水平，結果顯示YTHDF2、FOXO3基因在肺腺癌組織和癌旁正常組織中表達差異有統計學意義（58.39±21.21比49.06±17.36，13.16±4.33比23.24±7.63，t=3.26、15.38，P=0.001、＜0.001）。

2.2 YTHDF2、FOXO在肺腺癌組織及癌旁正常組織中的免疫組化結果 免疫組化結果顯示，YTHDF2、FOXO3基因主要定位于細胞質或細胞核，見圖1。YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中的高表達率分別為26.25%（21/80）、18.75%（15/80），明顯低于癌旁正常組織中的82.50%（66/80）、88.75%（71/80）（χ2=51.02、78.84，均P＜0.001）。

圖1 YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌組織及癌旁正常組織中的表達（免疫組織化學法×100）

2.3 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3表達相關性 GEPIA數據庫中分析顯示，肺腺癌中YTHDF2與FOXO3基因表達水平的對數值呈正相關性（R=0.36，P＜0.05）。

2.4 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白表達情況與病人臨床病理參數之間的關系 YTHDF2蛋白表達情況與肺腺癌病人年齡、淋巴結轉移和分化程度相關（P＜0.05）；與TNM分期、性別無關（P＞0.05）；FOXO3蛋白表達情況與肺腺癌病人性別和分化程度相關（P＜0.05）；與TNM分期、年齡、淋巴結轉移無關（P＞0.05）。見表1。

表1 YTHDF2、FOXO3蛋白與肺腺癌臨床病理特征的關系/例（%）

2.5 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白表達情況與肺腺癌病人3年生存情況的關系 病例隨訪的方式：采用電話或信件隨訪，隨訪時間從出院至最近一次隨訪，隨訪期限為3年。肺腺癌組織中YTHDF2蛋白高表達組和低表達組病人3年累積生存率分別為53.30%、14.00%，經Log-Rank比較，差異有統計學意義（χ2=24.60，P＜0.001）；FOXO3蛋白高表達組和低表達組病人3年累積生存率分別為64.50%、12.20%，經Log-Rank比較，差異有統計學意義（χ2=18.20，P＜0.001）。

3 討論

肺癌已經逐漸成為全球癌癥死亡的主要原因［6］。其中有87%被歸類為非小細胞肺癌，而肺腺癌和肺鱗狀細胞癌是主要的病理類型［7］。FOXO3是一種“腫瘤抑制因子”［8］，也是四種相關的FOXO轉錄因子之一，可保護細胞免受各種生理應激的影響［9］。FOXO3已被證明在DNA修復，生長停滯和細胞凋亡中具有重要作用［10］。研究表明FOXO3能夠激活促凋亡轉錄程序，并且可促進人類肺癌致癌物產生炎癥反應［11］。FOXO3定位于6號染色體，編碼673個氨基酸［12］。FOXO3在蛋白質中的水平受到絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）的影響。Akt能夠促進特定殘基上磷酸化FOXO3，并導致其胞質滯留和轉錄失活，同時Akt可被磷脂酰肌醇3-激酶信號激活［13］。FOXO3可以通過調節細胞增殖、遷移及血管生成參與癌癥的發生。研究發現，FOXO3還參與許多化療藥物（吉非替尼等）的作用機制［14］。另有研究顯示敲除FOXO3基因會促使腫瘤的發生，從而發現FOXO3作為抑癌基因發揮作用［15］。然而，其他研究報道FOXO3在腫瘤發生中起相反的作用，可促進腫瘤細胞的轉移。例如，有研究表明FOXO3既能抑制也能促進乳腺癌細胞的進展，且調節FOXO3活性對于腫瘤生長和轉移至關重要［16］。

YTHDF2能夠識別和削弱mRNA穩定性［17］。最新的報告稱YTHDF2是能夠降解兩種腫瘤啟動子并且能夠抑制腫瘤基因表達，增強干細胞自我更新能力［18］。癌細胞的代謝特征對于適應腫瘤微環境內的變化至關重要，通常有助于表觀遺傳可塑性［19］。Shen等［20］研究報道，YTHDF2在胃癌組織及細胞中均為低表達，其表達水平與胃癌分期及病人的生存期密切相關，可作為胃癌的預后標志物。另王月帆等［21］研究發現，肝癌組織中YTHDF2高表達，且YTHDF2高表達病人具有更低的總體生存率和無復發生存率，YTHDF2可作為判斷肝癌病人預后的分子標志物。但YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌中的作用尚不明確，因此本研究分析肺腺癌組織和癌旁正常組織中YTHDF2、FOXO3蛋白的表達變化。

本研究免疫組化結果發現，肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白高表達率均較癌旁正常組織低，FOXO3蛋白表達與TCGA數據庫中FOXO3基因表達的結果一致，而YTHDF2蛋白表達與TCGA數據庫中YTHDF2基因表達的結果不一致，考慮可能與本研究納入樣本量與TCGA數據庫中的樣本量相差較大有關，需擴大樣本進行驗證。另外，GEPIA數據庫中分析發現，肺腺癌中YTHDF2與FOXO3基因表達水平的對數值呈正相關。上述結果提示YTHDF2、FOXO3表達異常與肺腺癌的發生密切相關，FOXO3可能通過抑制轉錄因子的激活，從而降低相關基因的表達，抑制癌細胞的增殖。分析原因可能為YTHDF2、FOXO3蛋白具有DNA結合、轉錄活化和轉錄抑制等功能，與增生、分化、血管再生和侵襲等病理生理關系密切，是重要的細胞調控因子。本研究還發現，YTHDF2蛋白表達與肺腺癌病人年齡、淋巴結轉移和分化程度相關，而FOXO3蛋白表達與肺腺癌病人性別、分化程度相關，提示YTHDF2、FOXO3表達受多種因素影響，可能在肺腺癌病情進展中發揮作用。進一步分析發現，YTHDF2蛋白、FOXO3蛋白低表達組病人具有更低的3年累積生存率，提示YTHDF2、FOXO3異常低表達病人可能更易發生預后不良，對于此類病人，應及時采取措施干預，以提高病人的3年累積生存率，并改善生存質量。

綜上所述，YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中均呈低表達，與病人腫瘤分化程度和3年累積生存率有關，可作為評估預后的潛在標志物。但是本研究樣本量較少，可能存在一定的偏倚，后續還須擴大樣本繼續研究。