膀胱癌組織微RNA-212、微RNA-137、微RNA-200表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性及預(yù)測(cè)經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后復(fù)發(fā)的效能研究

張家興，張際青，楊云波，唐偉，劉海超，劉桂遷，李衛(wèi)旗，裴志圣

作者單位：河北燕達(dá)醫(yī)院泌尿外科，河北 廊坊065201

膀胱癌是十大常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其預(yù)后與腫瘤浸潤(rùn)程度、治療情況有關(guān)。對(duì)非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌給予經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（TURBT）+膀胱灌注治療，對(duì)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌常給予根治性膀胱全切術(shù)，準(zhǔn)確評(píng)估病理特征，明確膀胱癌浸潤(rùn)程度對(duì)臨床選取合適治療方式具有重要意義［1］。且無(wú)論是非肌層浸潤(rùn)性還是肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，治療后復(fù)發(fā)均是不良預(yù)后的獨(dú)立相關(guān)危險(xiǎn)因素，因此研究復(fù)發(fā)相關(guān)標(biāo)志物是必要的［2］。根據(jù)既往報(bào)道［3］，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是膀胱癌細(xì)胞發(fā)生肌層浸潤(rùn)、增殖復(fù)發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。微RNA-212（miRNA-212）、微RNA-137（miRNA-137）、微RNA-200（miRNA-200）均是非編碼單鏈RNA分子，其中敲低miRNA-212可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上調(diào)miRNA-137、miRNA-200表達(dá)可促進(jìn)直腸癌細(xì)胞侵襲與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，因此推測(cè)三者可能與膀胱癌臨床病理特征、增殖復(fù)發(fā)有關(guān)［4-6］。基于此本研究探討膀胱癌組織miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性及預(yù)測(cè)TURBT后復(fù)發(fā)的效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用SPSS 24.0確定樣本量與處理數(shù)據(jù)，n=［（Z1-α/2）2P（1-P）］/δ2，當(dāng)α=0.05時(shí)，Z1-α/2=1.96，P=0.36，δ=0.098，計(jì)算出所需最小樣本量n=92，為避免脫落、失訪等影響樣本量，n取100。選取2017年6月至2021年6月河北燕達(dá)醫(yī)院100例膀胱癌病人作為研究對(duì)象。其中女52例，男48例；年齡范圍44～80歲，年齡（64.88±7.25）歲；組織學(xué)類型均為膀胱尿路上皮癌。所有病人術(shù)前均詳細(xì)詢問(wèn)病史、癥狀、體征，完成體格檢查、輔助檢查（血常規(guī)、肝腎及其他必要的實(shí)驗(yàn)室生化檢查、尿細(xì)胞學(xué)和腫瘤標(biāo)志物、超聲、CT、MRI等必要的影像學(xué)檢查），其中92例術(shù)前完成病理活檢，8例行診斷性TURBT并完成腫瘤的病理診斷和分級(jí)、分期，同時(shí)切除腫瘤；結(jié)合術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后相關(guān)檢查，參考美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第8版本TNM系統(tǒng)T分期：Ta期39例，T1期37例，T2期10例，T3期8例，T4期6例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例；無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移70例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移30例，世界衛(wèi)生組織2004組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤28例，低級(jí)別乳頭狀尿路上皮癌32例，高級(jí)別乳頭狀尿路上皮癌40例；肌層浸潤(rùn)性膀胱癌28例，非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌72例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人簽署知情同意書(shū)。

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：符合膀胱癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；年齡＞18歲；能夠配合隨訪；需明確腫瘤的病理診斷和分級(jí)、分期，同時(shí)切除腫瘤；非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌；肌層浸潤(rùn)性膀胱癌病人保留膀胱綜合治療的外科治療手段。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：凝血功能明顯異常或全身出血性疾病；精神障礙，不能配合手術(shù)者；嚴(yán)重泌尿生殖系統(tǒng)感染者；髖關(guān)節(jié)強(qiáng)直、脊柱畸形等，不能采取截石位；嚴(yán)重的心臟血管疾病者；尿道狹窄未治或閉鎖，不能置入電切鏡；合并肺癌、肝癌等其他原發(fā)腫瘤者；免疫功能缺失者；嚴(yán)重的肺部疾病，不能耐受手術(shù)；嚴(yán)重心律失常、急性心肌梗死；嚴(yán)重糖尿病，血糖未能有效控制；近期發(fā)生腦血管意外。

1.2 方法

1.2.1 治療方法與隨訪 所有病人術(shù)前均完善影像學(xué)、病理等檢查，對(duì)符合相關(guān)指征病人給予TURBT，切除深度至膀胱壁的肌層，切除范圍包括腫瘤根部和基底層，燒灼瘤體基底周圍2 cm的正常尿路上皮黏膜，手術(shù)切除標(biāo)本送病理切片檢查，并取癌變組織旁2 cm的組織作為癌旁組織備測(cè)。行TURBT病人中，8例行診斷性TURBT明確腫瘤的病理診斷和分級(jí)、分期，同時(shí)切除腫瘤，結(jié)合圍手術(shù)期相關(guān)檢查最終明確為非肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌；64例完成術(shù)前病理活檢，行TURBT切除腫瘤，最終明確為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，組織學(xué)分型為膀胱尿路上皮癌；28例完成術(shù)前病理活檢，行TURBT作為保留膀胱綜合治療的外科治療手段，最終明確為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，組織學(xué)分型為膀胱尿路上皮癌。依據(jù)專家共識(shí)［8］，接受TURBT所有病人給予術(shù)后即刻膀胱灌注化療（術(shù)后規(guī)律行膀胱灌注化療），均按照以上專家共識(shí)規(guī)范完成治療。以門診方式隨訪1年，非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌隨訪中使用膀胱鏡檢查，一旦發(fā)現(xiàn)異常行活檢及病理檢查；肌層浸潤(rùn)性膀胱癌隨訪內(nèi)容包括體格檢查、血液生化檢查、胸部X線和B超（肝腎、腹膜后）、膀胱鏡檢查，統(tǒng)計(jì)病人復(fù)發(fā)率，并根據(jù)是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組。

1.2.2 miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200檢測(cè)主要試劑、儀器：SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物科技）；miRNA提取試劑盒（日?qǐng)?bào)Toyobo公司）；Taq DNA聚合酶（簡(jiǎn)稱Taq酶，美國(guó)Thermo Fisher公司）；ReverTra Ace熒光定量PCR試劑盒（上海擎科生物）；脫氧核苷三磷酸（dNTP，美國(guó)Thermo Fisher公司）；PCR儀器（7500型，美國(guó)ABI公司）。

檢測(cè)方法：取癌組織和癌旁組織標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)，Trizol試劑盒提取RNA，加入1 mL Trizol試劑，用勻漿器研磨成漿，裂解10 min，加入200 μL氯仿，混勻，4 ℃，12 000×g，10 cm半徑離心15 min，可見(jiàn)分成上（RNA）中（蛋白）下（DNA）三相。紫外分光光度法檢測(cè)260 nm和280 nm處的吸光度（absorbance，A）值，計(jì)算A260nm/A280nm比值，即RNA濃度為1.8～2.3符合要求。配置反轉(zhuǎn)錄體系：取RNA標(biāo)本1 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、通用反轉(zhuǎn)錄引物1 μL、緩沖液2 μL，補(bǔ)充重蒸水至10 μL，通用莖環(huán)引物序列5'-GAAAGAAGGCGAGGAGCAGATCGAGGAAGAAGACGGAAGAATGTGCGTCTCGCCT TCTTTCNNNNNNNN-3'，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：5 ℃ 5 min，10 ℃ 10 min，15 ℃ 25 min，37 ℃ 30 min，98 ℃ 5 min，合成互補(bǔ)DNA（cDNA）后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。配置PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：cDNA 1 μL、SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR液5 μL、引物2 μL、加入雙蒸水2 μL，總反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)，miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)量以相對(duì)內(nèi)參U6來(lái)表示。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較不同組織miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)。（2）比較不同病理特征病人miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)。（3）比較復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)組臨床資料、miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)。（4）分析miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的價(jià)值。（5）分析不同miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)水平病人復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0分析，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，以χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用受試者操作特征（ROC）曲線分析miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的價(jià)值，使用ROC曲線下面積（AUC）評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)可靠性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá) 癌組織miRNA-212低于癌旁組織，miRNA-137、miRNA-200表達(dá)高于癌旁組織。見(jiàn)表1。

表1 膀胱癌100例不同組織miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)/

表1 膀胱癌100例不同組織miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)/

注：miRNA為微RNA。

組別癌組織癌旁組織t值P值miRNA-200 24.56±7.39 7.33±2.21 22.34＜0.001例數(shù)100 100 miRNA-212 2.03±0.56 4.52±1.18 19.06＜0.001 miRNA-137 2.69±0.45 1.28±0.30 26.07＜0.001

2.2 不同病理特征病人miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá) 不同組織學(xué)分級(jí)、T分期、N分期、M分期病人miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著組織學(xué)分級(jí)、TNM分期遞增，miRNA-212表達(dá)逐漸降低，miRNA-137、miRNA-200表達(dá)逐漸升高（P＜0.05）；肌層浸潤(rùn)性膀胱癌病人miRNA-212低于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，miRNA-137、miRNA-200高于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 膀胱癌100例不同病理特征時(shí)miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)比較/

表2 膀胱癌100例不同病理特征時(shí)miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)比較/

注：miRNA為微RNA。

病理特征WHO2004組織學(xué)分級(jí)低度低級(jí)別高級(jí)別T分期Ta T1 T2 T3 T4 N分期N0 N1～N3 M分期M0 M1病理分型非肌層浸潤(rùn)性肌層浸潤(rùn)性例數(shù)miRNA-212t（F）值（78.41）P值＜0.001 miRNA-137t（F）值（53.07）P值＜0.001 miRNA-200t（F）值（124.48）P值＜0.001 28 32 40 1.28±0.36 1.74±0.41 2.79±0.66 3.85±1.07 2.77±0.84 1.81±0.51 38.06±7.23 22.13±5.19 17.05±4.22（38.72）＜0.001（197.98）＜0.001（143.79）＜0.001 39 37 10 8 6 6 7 4.11±0.73 3.60±0.62 3.02±0.65 2.11±0.58 1.12±0.34 1.80±0.33 2.56±0.39 3.89±0.46 4.94±0.67 6.22±0.95 10.26±2.22 16.59±2.84 21.01±3.56 29.44±4.79 38.52±6.80 20.80＜0.00120.80＜0.00115.12＜0.001 33 2.61±0.46 0.85±0.22 2.11±0.37 3.87±0.45 18.54±5.04 36.78±6.79 20.15＜0.00136.04＜0.00122.36＜0.001 70 30 2.48±0.37 0.98±0.26 1.86±0.33 4.63±0.40 17.22±4.18 41.69±6.59 13.18＜0.0019.48＜0.00117.16＜0.001 72 28 2.50±0.66 0.82±0.21 2.23±0.70 3.87±0.95 17.31±6.02 43.20±8.44

2.3 復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)組臨床資料、miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá) TURBT術(shù)后隨訪1年，無(wú)失訪病例，36例復(fù)發(fā)，64例未復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)組miRNA-212低于未復(fù)發(fā)組，miRNA-137、miRNA-200高于未復(fù)發(fā)組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的價(jià)值 繪制miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的ROC曲線顯示，miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200的AUC分別為0.82、0.79、0.80，三者聯(lián)合預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的AUC為0.93，見(jiàn)表4。

2.5 不同miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)水平病人復(fù)發(fā)率 miRNA-212高水平病人復(fù)發(fā)率低于低水平病人，miRNA-137、miRNA-200高水平病人復(fù)發(fā)率高于低水平病人（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 膀胱癌 100例中不同miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)水平病人復(fù)發(fā)率/例（%）

3 討論

miRNA-212位于染色體17p13.3，在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，并能調(diào)控腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程，但在膀胱癌中的研究較少［9］。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織miRNA-212低于癌旁組織，隨著組織學(xué)分級(jí)、TNM分期遞增，miRNA-212表達(dá)逐漸降低，與膀胱癌及其病理特征有關(guān)，扮演了抑癌基因角色。Zhang等［10］報(bào)道，在肺癌細(xì)胞中，miRNA-212表達(dá)降低，采用相關(guān)措施靶向miRNA-212，沉默miRNA-212表達(dá)，可促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移。Peng等［11］報(bào)道，前列腺癌中miRNA-212表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染miRNA-212模擬物，可顯著抑制癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，均提示miRNA-212具有抑癌基因作用，本研究觀點(diǎn)與之相似。miRNA-212除調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑外，還能通過(guò)泛素結(jié)合酶E2T、磷酸化蛋白激酶AKT3等途徑參與膀胱癌發(fā)病、進(jìn)展［12］。復(fù)發(fā)組miRNA-212低于未復(fù)發(fā)組，提示miRNA-212還與術(shù)后復(fù)發(fā)情況有關(guān)。miRNA-212預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的AUC為0.82，呈現(xiàn)出一定預(yù)測(cè)價(jià)值，能為臨床早期調(diào)整治療方案、隨訪管理等提供參考。但Mou等［13］報(bào)道敲低miRNA-212可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中的遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提示miRNA-212是一種促癌基因，本研究觀點(diǎn)與之不符，其可能的原因有：（1）所研究的惡性腫瘤種類不同導(dǎo)致的，說(shuō)明miRNA-212在不同惡性腫瘤中可能具有不同的調(diào)控機(jī)制，起到不同的調(diào)控作用；（2）本研究檢測(cè)標(biāo)本為人體的癌組織標(biāo)本，與Mou等［13］報(bào)道系體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相比，調(diào)控機(jī)制更復(fù)雜。鑒于miRNA-212在腫瘤領(lǐng)域尚存在爭(zhēng)議，下一步仍需完善質(zhì)控，進(jìn)一步檢測(cè)分析。

miRNA-137位于染色體1p22，在不同物種中其成熟序列的相似性幾乎為100%，揭示了在不同物種中miRNA-137可能執(zhí)行類似的生物學(xué)功能［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中miRNA-137表達(dá)高于癌旁組織，與張棟邦等［15］報(bào)道一致，提示miRNA-137與膀胱癌有關(guān)。在此研究基礎(chǔ)上本研究還發(fā)現(xiàn)，分化程度越低，TNM分期越高，miRNA-137表達(dá)越高，對(duì)膀胱癌惡性生物學(xué)特征起到正向調(diào)控作用，是一種促癌因子，有助于評(píng)估病人病理特征，從而為診斷、治療提供參考信息。根據(jù)Li等［16］報(bào)道，miRNA-137是通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)以及作用于下游磷酸化蛋白激酶AKT2途徑，影響癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的，但是否還有其他機(jī)制仍需后續(xù)的進(jìn)一步探討。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，與未復(fù)發(fā)病人相比，復(fù)發(fā)病人miRNA-137表達(dá)升高，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的AUC為0.79，可作為預(yù)測(cè)膀胱癌TURBT后復(fù)發(fā)的一個(gè)標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織miRNA-200表達(dá)高于癌旁組織，隨著組織學(xué)分級(jí)、TNM分期遞增，miRNA-200表達(dá)逐漸升高，與膀胱癌及其病理特征有關(guān)。一方面miRNA-200能促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞連接與極性喪失，另一方面miRNA-200能促進(jìn)癌癥細(xì)胞的干性，誘導(dǎo)新生血管生成與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而影響膀胱癌發(fā)生與進(jìn)展［17］。復(fù)發(fā)病人miRNA-200高于未復(fù)發(fā)病人，與復(fù)發(fā)有關(guān)。miRNA-200高水平病人復(fù)發(fā)率高于低水平病人，提示miRNA-200高水平病人不僅惡性生物學(xué)行為較高，且術(shù)后更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此對(duì)miRNA-200高水平病人，應(yīng)加強(qiáng)術(shù)后輔助治療，增加隨訪頻率，以便早期預(yù)防、發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)，促進(jìn)預(yù)后的改善。另本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的AUC為0.93，明顯高于任一單一指標(biāo)，可見(jiàn)三者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值更高，因此建議臨床聯(lián)合應(yīng)用，以提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，為臨床提供可靠的參考信息。本研究不足之處在于，納入的T3、T4分期病人數(shù)量較少，在統(tǒng)計(jì)分析miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200與病理特征關(guān)系時(shí)，可能會(huì)造成數(shù)據(jù)的偏倚，下一步仍需增加病人數(shù)量進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。

綜上，膀胱癌組織miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)TURBT后復(fù)發(fā)具有良好的預(yù)測(cè)能力，可作為預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的一種方案。