胃復春對胃黏膜腸化生患者胃黏膜菌群的影響?

沈 睿,肖 靈,華召來,陸 斌,李美鳳,周 平,張軍峰△

(1. 南京中醫藥大學醫學院,南京 210023;2. 揚中市腫瘤研究所,江蘇揚中 212299;3. 揚中市人民醫院,江蘇揚中 212299)

胃復春由紅參、香茶菜、炒枳殼組成,具有健脾益氣、活血解毒、扶正祛邪、攻補兼施之功效,臨床適用于胃癌前病變、胃癌手術后輔助治療、慢性胃炎脾胃虛弱證等[1]。胃黏膜腸化生(gastric intestinal metaplasia, GIM)是典型的胃癌前病變,也是胃癌的獨立風險因子[2]。慢性萎縮性胃炎伴GIM病因病機復雜,嚴重危害患者身心健康,目前尚無治療共識。臨床實踐顯示,益氣活血、健脾活血、理氣活血、溫陽活血等活血化瘀大法辨治胃癌前病變,能夠顯著緩解臨床癥狀,降低胃癌的發病率[3]。因此,具有益氣活血功效的胃復春已經成為臨床消化內科最常用中成藥之一[4]?，F代研究顯示,胃復春可以促進胃黏膜修復再生,改善局部胃黏膜血液循環,增強機體免疫功能,抑制幽門螺桿菌,改善胃黏膜萎縮,降低胃黏膜癌變異型增生/腸化生等級[5]。最近研究發現,胃復春治療胃癌前病變患者(包括GIM),能夠顯著改善患者癥狀、降低胃黏膜GIM病理等級,同時改善舌苔菌群,特別是胃復春治療增強了兩個舌苔菌群預測功能(膽汁酸分泌和葉酸合成)[6],促進膽汁分泌和增強脂質代謝可能體現了胃復春活血化瘀功效。

在生理狀態下,胃液菌群密度為102～104CFU/mL,胃內菌群平衡,可抵御病原菌入侵,大量高通量菌群測序研究發現胃內菌群失調與胃炎、胃潰瘍以及胃癌前病變相關[7]。在Correa級聯(正常胃黏膜-慢性胃炎-癌前病變-胃癌)過程中,胃內菌群多樣性逐漸降低,特別是晚期胃癌階段,胃內酸性條件被破壞,導致口腔和腸道菌群在胃癌組織富集[8];慢性萎縮性胃炎患者胃菌群豐度和多樣性顯著高于胃癌患者[9];胃上皮內瘤變患者胃菌群多樣性顯著低于GIM患者。這些結果提示,胃菌群參與胃癌前病變的發生發展,調節胃內菌群可能是防治胃癌前病變的關鍵策略。因此,本研究觀察了胃復春治療對GIM患者胃菌群的影響,為探索胃復春防治胃癌前病變的功效機制提供新思路。本研究經揚中市人民醫院臨床倫理委員會批準:編號PHYC201605。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究遵循《赫爾辛基宣言》《涉及人的生物醫學研究倫理準則》等有關規定,臨床招募2018年11月—2019年6月在楊州市人民醫院經胃鏡病理確診的GIM患者37例為胃復春治療組,選擇同期醫院體檢無異常的健康者31例作為對照組。

1.2 診斷標準

參照《中國早期胃癌篩查及內鏡診治共識意見(2014年4月·長沙)》[10]診斷GIM,方法簡述:空腹禁食8 h以上,進行胃鏡檢查,根據共識意見[11]進行胃鏡檢查和取樣。胃鏡檢查取樣包括賁門、胃體小彎、胃體大彎、胃竇小彎、胃竇大彎、幽門等5個部位,胃黏膜樣本大小1～2 mm,取雙份樣本。胃黏膜樣本用10%甲醛固定后,按照取樣位置進行擺放并石蠟包埋,常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色進行病理分析,參考典型的胃黏膜腸化生判別重度、中度和輕度,見圖1。取樣任一部位出現腸化生則取相應的另一份樣本。5個部位均無腸化生者作為對照組,取胃竇黏膜,進行菌群測序。

注:正常胃黏膜表現為黏膜上皮和腺體排列整齊規則。胃黏膜腸化生表現為黏膜炎癥、腺體萎縮,可分為輕、中、重度腸化生,輕度表現為腸化區占腺體和表面上皮總面積的1/3以下,中度表現為腸化區占腺體和表面上皮總面積的1/3到2/3,重度表現為腸化區占腺體和表面上皮總面積2/3以上。

1.3 納入標準

對照組納入標準:無消化道不適癥狀,如胃痛、胃脹、腹痛、腹脹等。胃復春治療組納入標準:符合GIM病理診斷標準;年齡18～70歲之間;無消化道不適癥狀,如胃痛、胃脹、腹痛、腹脹等;患者對本研究知情,自愿參加并簽署知情同意書。

1.4 排除標準

近1個月內使用過質子泵抑制劑、非甾體抗炎藥、益生菌、抗生素等;腫瘤病史或心、肝、腎、肺嚴重器質性病變者;食管或胃黏膜手術史者;女性受試者處于妊娠或哺乳期;對本研究用藥過敏者。

1.5 藥物干預

每次發放2周的胃復春片(杭州胡慶余堂藥業有限公司,40片/盒,國藥準字Z20040003,批號為1806648),囑患者按時服藥,1日3次,1次4片。每周回訪1次,治療4周。停藥1周后,行無痛胃鏡病理復查。服藥期間避免煙酒和辛辣飲食。

1.6 胃黏膜菌群檢測與分析

胃黏膜菌群檢測委托上海凌恩生物科技有限公司,方法簡述如下:提取胃黏膜總DNA,用16S rRNA通用引物338F-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG,806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT進行PCR擴增,利用擴增產物建立Miseq PE文庫用于高通量測序,QIIME(version 1.17)優化測序數據,按照97%相似性,用UPARSE35(version 7.1)軟件實現可操作單元(operational taxonomic unit,OUT)聚類分析,利用Visual Genomics軟件(Release 1,上海盈飛生物)進行Alpha多樣性、群落結構和線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)或LEfSe(LDA EFfect Size)分析等,利用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)進行菌群的京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes,KEGG)功能分析。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析,R軟件(Version 3.4.2)的pheatmap、ggplot2實現圖形可視化,GraphPad Prism(Version 8.0.1)繪制箱形圖和小提琴圖,所有統計檢驗為雙尾,P<0.05表示顯著統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

研究人群包括31例對照組和37例GIM患者,其中,對照組和GIM組年齡分別為(62.1±3.4)和(62.2±3.5)歲,性別分布(男/女)分別為14/17和17/20,體質量指數(body mass index,BMI)分別為(24.2±2.4)和(24.4±3.2),差異均無顯著統計學意義(P>0.05)。37例GIM患者腸化等級表現為輕度24例、中度11例、重度2例;胃復春治療后,胃鏡病理報告顯示,23例患者腸化生未檢出,5例患者GIM等級下降,腸化生等級改善有效率75.7%。GIM患者經胃復春治療前后,快速尿素酶試驗陽性率分別為29.7%(11/37)和37.8%(14/37),差異無統計學意義(P>0.05);治療前后,GIM患者血清胃蛋白酶原比率(PG I/ Ⅱ)分別為(3.16±0.95)和(4.10±1.12),差異具有顯著統計學意義(P<0.05);治療前后,GIM患者胃黏膜炎癥活動比例分別為56.8%(21/37)和32.4%(12/37),差異具有極顯著統計學意義(P<0.01)。這些結果提示胃復春對幽門螺桿菌感染無顯著影響,但可以改善胃黏膜萎縮程度和黏膜炎癥活動。

2.2 胃復春對GIM患者胃黏膜菌群多樣性的影響

本研究每份胃黏膜平均檢測到(34 430±12 474)條有效序列,評估胃復春對胃黏膜菌群多樣性的影響,4個alpha多樣性指數中,Ace、Chao和Observed OTUs表示菌群豐富度,Shannon表示菌群多樣性。采用非參數曼-惠特尼U檢驗(Mann-WhitneyUTest)分析對照組、GIM患者治療前與治療后的多樣性指數,結果顯示,GIM患者胃黏膜菌群豐富度指數Ace和Chao均顯著高于對照組(P<0.01),胃復春治療后胃黏膜菌群3個豐富度指數均顯著高于治療前(P<0.001);然而,菌群多樣性Shannon指數無顯著變化(P>0.05),見圖2。因此,胃復春治療增加了GIM患者胃黏膜菌群的豐富度,但對菌群多樣性無顯著影響。

注:綠色點表示對照組(Control),紅色點和藍色點表示GIM患者,紅色表示胃復春治療前,藍色表示胃復春治療后;**P<0.01,***P<0.001;胃黏膜腸化生(GIM)

2.3 胃復春對GIM患者胃黏膜菌群結構的影響

本研究所有胃黏膜樣本共檢測到1 106個OTUs,歸屬于30門、63綱、144目、253科和616屬。菌群的群落結構和beta多樣性分析顯示,胃復春治療GIM患者后,胃黏膜菌群發生了顯著變化,見圖3。在門水平,胃黏膜菌群結構顯示,優勢菌門(相對豐度>1%)由高到低依次為變形菌門(Proteobacteria)、ε-菌門(Epsilonbacteraeota)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和梭桿菌門(Fusobacteria),見圖3a。在屬水平,對照組胃黏膜優勢菌主要為雷爾氏菌屬(Ralstonia)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、Labrys、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、Pseudolabrys、Hydrobacter、貪噬菌屬(Variovorax);胃復春治療后,除螺桿菌屬(Helicobacter)外,GIM患者胃黏膜優勢菌屬發生顯著變化,治療前的GIM患者胃黏膜優勢菌屬與對照組類似,包括假諾卡氏菌屬、中慢生根瘤菌屬、雷爾氏菌屬等,治療后的GIM患者胃黏膜優勢菌屬包括鏈球菌屬(Streptococcus)、普雷沃菌7(Prevotella7)、奈瑟菌屬(Neisseria)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、鹽單胞菌屬(Halomonas),見圖3b。主坐標分析(Principal coordinate analysis,PCoA)進一步證實,胃復春治療后顯著改變了GIM患者胃菌群狀態,見圖3c。

A.為胃黏膜菌群優勢菌門結構圖;b.胃黏膜菌群前30位相對豐度熱圖;c.胃復春治療GIM胃黏膜菌群主坐標分析(PCoA)

在門水平,與對照組相比,GIM患者胃Epsilonbacteraeota和Fusobacteria豐度顯著升高,Proteobacteria豐度顯著下降;與治療前的GIM組相比,胃復春治療組(GIM+Weifuchun),Epsilonbacteraeota、Bacteroidetes、Firmicutes和Fusobacteria豐度顯著升高,Proteobacteria豐度顯著降低(P<0.05),見圖4。

注:與對照組(Control)比較**P<0.01,***P<0.001;與GIM組比較##P<0.01,###P<0.001

2.4 胃復春治療GIM患者相關胃黏膜標志菌群分析

LEfSe分析或LDA分析是一種用于發現和解釋高維度數據生物標識(基因、通路和分類單元等)的分析工具,可以進行2個或多個分組的比較,強調統計意義和生物相關性,能夠在組與組之間尋找具有統計學差異的生物標識。以對照組和治療前GIM患者進行LEfSe分析,結果顯示,螺桿菌屬、梭桿菌屬(Fusobacterium)、普雷沃菌屬1(Prevotella1)、羅氏菌屬(Rosia)等27個細菌分類單元富集在GIM組,放線菌屬(Actinomyces)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)等11個細菌分類單元富集在對照組,見圖5。在治療前的37例GIM患者中,LDA分析顯示,輕度GIM未見標志菌群,嗜氫菌科(Hydrogenophilaceae)、陶厄氏菌屬(Thauera)、副擬桿菌(Parabacteroides)等9個分類單元富集在中度GIM組;黃桿菌屬(Flavobacterium)、微單孢菌科(Micromonosporaceae)和微單孢菌目(Micromonosporales)富集在重度GIM組,見圖6,提示胃黏膜菌群與GIM嚴重程度相關。

注:對胃復春治療前的GIM組(GIM patients)與對照組(Control)進行線性判別(LEfSe)分析,展示差異細菌分類單元,紅色表示在GIM組顯著升高的菌群,綠色表示在對照組顯著升高菌群;圖中節點表示細菌分類單元,自內向外每圈的節點表示不同的門、綱、目、科、屬

注:按照腸化生輕、中、重程度治療前GIM患者分組,進行胃黏膜菌群線性判別(LDA)分析,紅色表示中度腸化生組(Moderate GIM)顯著升高的細菌分類單元,綠色表示重度腸化生組(Severe GIM)顯著升高的細菌分類單元;g_表示屬(genus),f_表示科(family),o_表示目(order),c_表示綱(class)

最后,采用LDA分析胃復春治療相關胃黏膜標志菌群,16個菌屬富集在胃復春治療組,見圖7,其中,5個優勢菌屬(相對豐度>1%)分別為不動桿菌屬(Acinetobacter)、羅氏菌屬(Rothia)、放線菌屬(Actinomyces)、梭桿菌屬(Fusobacterium)和纖毛均屬(Leptotrichia),其他菌屬包括奇異菌屬(Atopobium)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、Sediminibacterium、月形單胞菌屬3(Selenomonas3)、假節桿菌屬(Pseudarthrobacter)和柄桿菌屬(Caulobacter)等,這些菌屬在胃復春治療的GIM患者胃內豐度均顯著上升(P<0.05),可能是胃復春治療GIM的潛在靶點或標志菌群。

注:在屬水平采用線性判別(LDA)分析,藍色表示在對照組(Control)胃黏膜豐度顯著升高的菌屬,紅色表示胃復春治療前GIM組(GIM)胃黏膜中豐度顯著升高的菌屬,綠色表示胃復春治療后GIM組(GIM+Weifuchun)胃黏膜中豐度顯著升高的菌屬;LDA評分越高,表示差異越顯著

2.5 胃復春治療GIM相關胃黏膜菌群預測功能方法

利用PICRUSt推斷菌群功能譜,通過LDA分析胃復春治療GIM的胃菌群KEGG預測功能,發現7個菌群預測功能與胃復春治療相關,見圖8,為ABC轉運蛋白(ABC transporters)、膜轉運(Membrane Transport)、脂類代謝(Lipid Metabolism)、脂肪酸代謝(Fatty acid metabolism)等。

注:基于胃黏膜菌群KEGG預測功能進行線性判別(LDA)分析,灰色表示在對照組(Control)顯著增強的預測功能,紅色表示胃復春治療前(GIM)顯著增強的預測功能,綠色表示胃復春治療后(GIM+Weifuchun)顯著增強的預測功能;LDA評分越高,表示差異越顯著

3 討論

胃復春治療萎縮性胃炎癌前病變臨床應用專家共識認為,胃復春適用于萎縮性胃炎癌前病變,病理診斷為萎縮性胃炎伴腸化生和/或低級別上皮內瘤變者尤為適宜,對胃虛弱證、胃絡瘀血證患者更具優勢[12]。薈萃分析顯示,胃復春治療CAG的主要機制包括促進幽門螺桿菌轉陰、改善胃黏膜萎縮病變、促進胃黏膜修復、維持胃微生物生態系統平衡[13]。王桂彬等針對胃癌辨治提出“求衡復運”理論,核心要義在于“求衡于五臟,復運于脾胃”,體現了“無致邪,無伐正”的中和思想[14]。因此,恢復胃部菌群平衡是防治胃癌的關鍵機制。本研究發現,胃復春治療可顯著改善GIM患者腸化生等級、重塑胃黏膜微生態系統。本研究中,所有人群的胃黏膜優勢菌門結構與前期研究類似[15],胃復春治療后,GIM患者胃黏膜常見的羅氏菌屬豐度顯著升高,前期研究發現胃癌組織的羅氏菌屬豐度顯著低于胃癌旁組織[16],提示胃復春治療能夠降低胃癌風險。同時,胃復春治療顯著升高GIM患者胃黏膜鞘脂菌屬豐度,研究發現鞘脂菌屬可降解具有細胞毒性和致癌性的外源性芳香烴類化合物,其豐度與進展期胃腺癌顯著負相關[17],鞘脂菌屬可能是GIM消退的胃黏膜標志菌屬[18]。因此,胃復春治療能夠改善GIM患者胃黏膜菌群,降低胃癌發生風險。

進一步分析胃黏膜菌群KEGG功能預測,胃復春治療后,ABC轉運蛋白、脂類代謝和脂肪酸代謝功能顯著增強。研究表明,ABC轉運蛋白在細胞中參與代謝解毒、脂質穩態平衡(如高密度脂蛋白的合成)、病毒防御等重要生理過程,與腫瘤多藥耐藥性相關[19]。前期研究顯示,舌苔脂質代謝紊亂是胃癌前病變的重要特征[20]。現代研究認為,脂質代謝紊亂是“痰濁”“瘀血”的重要物質基礎[21],胃復春治療萎縮性胃炎癌前病變脾胃虛弱證、胃絡瘀血證患者更具優勢[12]。胃復春組方源于“養正積自除”理論,以扶正為主,攻補兼施,共同實現“治、養、護”一體,共奏健脾益氣、活血解毒之功效,因此,胃復春臨床不僅適用脾胃虛弱證,也應適用胃絡瘀血證[22]。本研究結果提示,胃復春防治GIM可能與增強脂質代謝功能相關,體現了胃復春活血化瘀功效,為拓展胃復春的臨床適應證提供了新的證據。

中醫認為,脾氣虛損,則運化無權、升降失司,水谷精微代謝失常則聚濕成痰;氣為血帥,氣行則血行,氣虛則推動無力,血行不暢,瘀血內阻,痰濕瘀濁滋生[23]。故推測,胃復春補氣健脾、活血益氣,可能與增強胃部黏膜血液循環、緩解胃黏膜充血缺氧相關。研究顯示,胃復春入血成分以香茶菜二萜類成分為主,網絡藥理學分析發現磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B、酪氨酸激酶-信號轉導子與轉錄激活子、缺氧誘導因子-1、血管內皮生長因子、Wnt、表皮生長因子受體、p53 信號通路可能是胃復春有效治療GIM的關鍵通路,分子對接分析顯示,槲皮素、橙桑黃酮F、藍萼甲素、香茶菜素O、香茶菜素U、藍萼乙素、5-去甲基川陳皮素、冬凌草素等成分通過調控胃黏膜腸化生組織增殖、凋亡過程發揮逆轉GIM作用[24],但尚未見胃復春改善胃菌群的功效物質基礎研究,本研究為揭示胃復春防治胃癌前病變的微生態機制提供了臨床證據。

綜上,胃復春治療GIM有效,與改變胃黏膜菌群、增強脂類代謝、脂肪酸代謝功能相關,然而,胃菌群易受環境、宿主狀態、季節等干擾,故研究結果需要多中心、更大樣本量驗證。在未來的研究中,需要在體內外水平深入揭示胃復春逆轉GIM的藥效物質基礎,為臨床應用胃復春防治胃癌前病變提供科學證據。