基于HPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS整合網絡藥理學研究衢枳殼降糖的物質基礎及作用機制?

姜莉苑,董 馨,田雨欣,宋劍鋒,趙維良,胡穎菲,李夢盈,馮敬騫△

(1.衢州職業技術學院,浙江衢州 324000;2.內蒙古醫科大學藥學院,呼和浩特 010110;3.衢州市食品藥品檢驗研究院,浙江衢州 324000;4.浙江省食品藥品檢驗研究院,杭州 310052)

據糖尿病國際聯盟最新報道,2021年全球成人糖尿病患者約5.37億,預計到2045年糖尿病患病人數將上升到7.83億[1]。中藥在防治復雜疾病上具有療效穩定、不良反應小、多靶點同時作用的特點,從天然藥物中篩選具有降糖作用的中藥作為補充或替代療法已成為糖尿病治療研究熱點[2-3]。衢枳殼,俗稱“胡柚片”,為蕓香科植物常山柚橙(Citrus aurantium ‘Changshanhuyou’)的干燥未成熟果實,居“衢六味”品種之首。其性味苦、辛、酸,微寒,歸脾、胃經,具有理氣寬中、行滯消脹的功效[4-5]。本品于2016年被《浙江省炮制規范(2015版)》收載,在浙江省內作為枳殼替代品使用,化學成分和藥效作用與枳殼基本相同[6-7]。目前,臨床上將枳殼應用于治療糖尿病及其并發癥[8-10]。雖衢枳殼治療糖尿病的臨床應用鮮有報道,但已有藥理學實驗證明衢枳殼提取物可促進腺苷酸活化蛋白激酶 (adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)的活化,抑制肝臟脂質累積,從而明顯改善2型糖尿病小鼠胰島素抵抗[11]。另有研究證實衢枳殼中的柚皮素和橙皮素可通過降低硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP),抑制組蛋白乙酰化修飾過程,對胰島B細胞起到保護作用[12]。然而這些研究主要通過比較分散的靶點來探討其治療糖尿病的作用機制,對全面闡釋衢枳殼的降糖作用及特點存在著一定的局限性,不足以科學完整地揭示其內在本質。近年來,網絡藥理學被廣泛應用于中醫藥治療復雜疾病的機制研究[13-17]。網絡藥理學的系統性和協同性與中醫藥“整體觀”研究思路有相同之處,將“一靶一藥”轉變為“多靶點、多成分”已成為探索中藥作用機制的強有力研究策略。

本研究采用高效液相色譜串聯四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(HPLC-Q- Exactive Orbitrap MS/MS)技術對衢枳殼給藥后血中移行成分進行分析和表征,構建衢枳殼中活性成分庫,并基于網絡藥理學技術,預測衢枳殼治療糖尿病的關鍵靶點、通路,為后續衢枳殼的降糖作用機制研究提供科學依據和數據支撐,并為衢枳殼藥用價值的開發和臨床合理應用奠定基礎。動物實驗經內蒙古醫科大學醫學倫理委員會批準,批準號:YKD202301189。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD大鼠,雄性,體質量180～240 g,由內蒙古醫科大學動物中心提供,動物許可證號:SCXK(蒙)2020-0 003。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

橙皮苷(批號:wkq21020906;純度>98%);新橙皮苷(批號:wkq21020406;純度>98%);柚皮苷(批號:wkq21020606;純度>98%);蕓香柚皮苷(批號:wkq20060103;純度>98%);柚皮素(批號:wkq21022409;純度>98%);川陳皮素(批號:wkq21030909;純度>98%)對照品均購自四川維克奇生物科技有限公司。衢枳殼飲片(批號:2012135)購自衢州南孔中藥有限公司,經衢州市食品藥品檢驗研究院主任中藥師宋劍鋒鑒定,為蕓香科植物常山胡柚的干燥未成熟果實。甲醇(貨號:210386)、乙腈(貨號:216058)均為色譜純,購自美國Fisher公司。乙醇(貨號:A20221161)、甲酸(貨號:20220202)均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

17-Exactive液相色譜-質譜聯用儀,美國Thermo-Fisher公司;AL204電子分析天平,瑞典METTLERTOLEDO公司;N-1100旋轉蒸發儀,上海愛朗儀器有限公司;FDU-1200冷凍干燥機,日本東京理化公司;CVE3110真空濃縮儀,日本東京理化公司。

2 方法

2.1 衢枳殼入血成分鑒定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18柱(2.7 μm,100 mm×3.0 mm);流動相A為乙腈,B為0.3%甲酸-水,梯度洗脫 0～5 min,90%～80%B;5～10 min,80%～60%B;10～25 min,60%～55%B;25～35 min,55%～0%B;流速為 0.3 mL/min,柱溫為35 ℃,進樣體積為5 μL。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源正負離子模式(ESI +/-)、Full MS/ddMS2模式,鞘氣流速40 L/min;輔助氣流速2 L/min;錐孔電壓為3 500 V(-)和4 000 V(+);碰撞電壓為30 eV;S-lens RF level 50 kV;毛細管離子傳輸管溫度為300 ℃;加熱溫度為350 ℃。

2.1.3 供試品制備 取衢枳殼粉末(過二號篩)100 g,加64%甲醇1 880 mL,加熱回流提取2次,每次1 h,濾過,合并濾液,濃縮,凍干后即得衢枳殼提取物,并放入-20 ℃冰箱保存備用。

2.1.4 對照品溶液制備 精密稱取各標準對照品適量,分別置于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解、定容,得到1 mg/mL的各標準對照品儲備液。根據需要用甲醇逐級稀釋至所需濃度,置于4 ℃冰箱保存備用。

2.1.5 血漿樣品制備 將所有大鼠隨機分為空白組和給藥組,每組6只。試驗前12 h禁食,正常飲水,給藥組給予衢枳殼提取物藥液(給藥劑量為臨床給藥劑量的6倍,36 g/kg),空白組給予等量蒸餾水。結合相關文獻[12]及前期預實驗結果,灌胃給藥2 h后,腹腔麻醉,隨后經腹主動脈采集全血,置于含肝素鈉的采血管中,靜置30 min后以15 984 g離心10 min,分離得上層血漿,并置于-20 ℃冰箱冷凍保存備用。

150 μL空白血漿中加入50 μL混合對照品溶液,渦旋1 min后4 ℃下以15 984 g離心10 min,吸取上清液,制得含混合對照品的血漿樣品。

2.1.6 血漿樣品處理 用600 μL甲醇提取200 μL血漿,渦旋3 min后靜置10 min,將萃取混合物于4 ℃下以15 984 g離心10 min,吸取上清液,并于真空濃縮儀中濃縮干燥。用100 μL 甲醇復溶殘余物后渦旋1 min,離心10 min,吸取上清液于液質小瓶內,待進樣分析。含混合對照品的血漿處理方法同上。

2.1.7 結構鑒定數據處理 結合Mass Frontier軟件獲取各化合物分子式,質譜偏差范圍為δ≤10×10-6,模擬出碎片離子的結構式,結合Scifinder等數據庫及相關文獻報道推測可能的化合物結構及裂解方式。此外,通過對照品對鑒定的化學成分進一步確定,而未能獲得對照品的化合物則根據以上方法進行初步結構推測鑒定。

2.2 網絡藥理學分析

2.2.1 衢枳殼入血成分靶點、疾病靶點的篩選 從TCMSP數據庫中收集衢枳殼入血成分的Pubchem Cid,借助SuperPred和Swiss Target Prediction數據庫,獲取成分作用靶點,去重后得到衢枳殼各成分靶點數據庫。使用GeneCards數據庫和OMIM數據庫,以“diabetes”為關鍵詞搜索疾病的相關靶點并進行標準化處理,去除重復后即得糖尿病相關靶點。

2.2.2 蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)網絡構建和核心靶點的篩選 為確定成分靶點和疾病靶點之間的作用關系,需通過Venny 2.1.0網站制作韋恩圖。將收集得到的成分靶點和疾病靶點分列導入集合中,并將兩部分集合各自命名,中間交集部分即為潛在靶點。將篩選出的衢枳殼各化學成分、潛在靶點以及疾病“diabetes”導入Cytoscape 3.9.1軟件中,形成“成分-靶點-疾病”相互作用網絡。將衢枳殼的潛在作用靶點上傳至String數據庫,分析結果繼續導入Cytoscape3.9.1軟件,構建蛋白質相互作用的PPI 可視化網絡,通過篩選網絡拓撲學關鍵性質來確定核心靶點。

2.2.3 GO和KEGG富集分析的構建 于DAVID數據庫中對上述篩選出的32個核心靶點開展通路富集分析,把參數(Select Identifier)設置為OFFICIAL GENE SYMBOL,列表類型為Gene list,限定物種為人,其他均為默認值,獲取GO和KEGG富集分析結果,再使用微生信平臺對得到的結果進行可視化分析,以用于后期試驗驗證。

2.2.4 分子對接驗證 選擇篩選過的在PPI網絡中排名前5位的核心靶點及核心成分進行分子對接模擬。在PubChem數據庫中下載化合物的2D或3D結構,借助Chem3D軟件進行結構優化,將其另存為“PDB”格式,作為小分子配體。在RCSB PDB數據庫中下載靶點蛋白的3D 晶體結構,并使用PyMOL軟件去除水分子和自由基,加氫。采用Autodock 1.5.7軟件進行分子對接,對接分數越低,代表結合越穩定。

3 結果

3.1 入血成分鑒定結果

基于查找出的衢枳殼中的化學成分,結合相關文獻[18-19]及質譜一級、二級分子量信息,利用Xcalibur軟件,在正離子及負離子掃描下,共識別出化合物20個。各模式下總離子流圖見圖1。化合物詳細結果信息見表1。

A.為正離子模式;b.為負離子模式

A.成分靶點和疾病靶點韋恩圖; b.成分-靶點-藥物相互作用網絡圖

表1 衢枳殼入血成分鑒定

3.2 網絡藥理學分析結果

3.2.1 活性成分-靶點-疾病靶標關聯網絡 檢索SuperPred和Swiss Target Prediction數據庫,去重后得到成分相關靶點226個;將從GeneCards(篩選Relevance score>1的靶點)與OMIM兩數據庫富集得到的靶點整合去重,得到疾病相關靶點1 361個。運用VENNY2.1.0將成分靶點和疾病靶點做韋恩圖,獲得到的交集靶點即為衢枳殼治療糖尿病的潛在靶點170個,結果見圖2a。將上述20個化學成分、1個藥物、170個潛在靶點導入Cytoscape-3.9.1軟件,繪制成分-靶點-藥物關聯網絡,結果見圖2b。在網絡中,共191個節點(1個藥物節點,20個化學成分節點,170個靶點節點),775條邊,其中紅色三角形代表衢枳殼,紫色箭頭代表各化學成分,黃色圓形代表靶點基因。

3.2.2 核心靶點網絡 上傳潛在靶點至String數據庫,獲取蛋白質互作網絡,導出數據,篩選Degree unDir(18.662 65),Closeness unDir(0.002 78),Betweenness unDir(203.759 03)以上的32個靶點為核心靶點見圖3。

圖3 衢枳殼核心靶點關聯網絡

3.2.3 GO功能富集和KEGG信號通路分析結果 將篩選出的32個核心靶點于DAVID數據庫中進行功能富集和信號通路分析,篩選P<0.05,結果顯示生物過程(biological process, BP)共涉及215個,主要有基因表達的正負調控、轉錄的正調控,DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄過程的正調控,凋亡過程的正調控等;分子功能(molecular function, MF)共涉及61個,主要有酶結合、相似蛋白結合、轉錄因子活性序列特異性DNA結合、轉錄因子RNA聚合酶Ⅱ序列特異性DNA結合等;細胞組分(cellular component, CC)共涉及28個,主要有高分子配合物、細胞質、細胞外空隙、胞外區、核染色質等,繪制的GO功能富集圖見圖4。KEGG信號通路分析結果主要包括:缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor, HIF)-1信號通路、晚期糖基化終末產物 (advanced glycation end products, AGE)-晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)信號通路、癌癥蛋白聚糖信號通路、化學致癌-受體激活通路等。KEGG通路氣泡圖如圖5所示。

圖4 衢枳殼核心靶點GO功能分析

圖5 衢枳殼核心靶點KEGG通路氣泡圖富集分析

3.2.4 分子對接結果 將PPI網絡中度值排名前5位的靶蛋白與“成分-靶點-通路”網絡對應的度值前5位的有效成分進行分子對接驗證。通過分子對接驗證兩者間結合活性,結果見圖6。結果顯示,衢枳殼中度值排名前5的核心成分蘆丁、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷、川陳皮素與5個核心靶點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC serine/threonine-protein kinase, AKT)1(PDBID:1 UNQ)、白蛋白(albumin, ALB)(PDBID:6YG9)、細胞腫瘤抗原p53(Cellular tumor antigenp 53, TP53)(PDBID:1GZH)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)(PDBID:5UUI)、表皮生長因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)(PDBID:2XKN)的靶點結合能均小于0,這表明活性成分能與對應靶點自發結合,且結合能越小表明對接越穩定(1 kcal=4.186 J)。其中、ALB、TP53、EGFR與5個核心成分的結合能均<-6.0 kcal/mol表明它們對接穩定并具有較好活性。而橙皮苷與ALB(PDBID:6YG9)、蕓香柚皮苷與ALB(PDBID:6YG9)均<-10 kcal/mol表明它們的活性較高。運用Discovery studio進行可視化分析,部分結果如圖7所示。

圖6 分子對接結果熱圖

A.新橙皮苷-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)1; b.橙皮苷-白蛋白(ALB); c.蕓香柚皮苷-白蛋白(ALB); d.橙皮苷-細胞腫瘤抗原p53(TP53)

4 討論

本文采用HPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS聯合網絡藥理學技術探究衢枳殼降糖的物質基礎及作用機制,同時借分子對接技術對衢枳殼發揮降糖作用的機制進行了驗證。結果顯示衢枳殼降糖過程中存在多成分、多靶點協同起效的現象。

本研究結果顯示,采用衢枳殼提取物灌胃給藥后,有20個成分入血吸收,其中蘆丁、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷、川陳皮素等成分與糖尿病關鍵靶點結合能低,活性較高,因此,推測以上5個成分為衢枳殼治療糖尿病的關鍵起效成分。相關報道顯示,蘆丁可通過促進胰島素對葡萄糖的攝取率和利用率,提升機體對胰島素的敏感度,進而改善患者血糖[20]。橙皮苷可通過抑制腎臟組織中mRNA的表達,進而改善腎功能、減輕蛋白尿,保護糖尿病引發的腎功能損傷[21]。另有學者發現,新橙皮苷則通過增加肝細胞中葡萄糖的消耗,發揮降糖和降脂功效[22]。Chen等[23]發現蕓香柚皮苷可有效防治糖尿病腎病,能夠降低細胞外基質的積累,增加基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP) -2的表達。此外,川陳皮素對改善急性腎臟損傷、恢復腎功能有積極作用[24]。

網絡藥理學結果顯示,AKT1、ALB、TP53、TNF、EGFR等為衢枳殼降糖過程中核心靶點,與以往研究結果一致。其中AKT1在調節細胞的生存、蛋白合成、血管形成以及胰島素依賴的細胞應答、新陳代謝等方面發揮重要作用[25-26]。而ALB基因則可直接作用于腎小球[27]。TP53則可通過調節葡萄糖的轉運,控制糖酵解和糖異生等延緩糖尿病進程。不少研究表明,TNF信號通路可以影響細胞存活和分化及免疫和炎癥反應[28],進而抑制糖尿病并發癥的發生。此外,本研究借助GO和KEGG分析,發現衢枳殼通過調控HIF-1信號通路、AGE-RAGE信號通路、EGFR信號通路等發揮降糖作用。HIF-1信號參與抑制氧化應激、腎功能保護過程[29]。AGE-RAGE信號通路也被證實是糖尿病腎病的重要發病通路之一[30]。

綜上所述,衢枳殼中的蘆丁、新橙皮苷、橙皮苷、蕓香柚皮苷、川陳皮素等活性成分可能為衢枳殼降糖的物質基礎,且通過作用于AKT1、ALB、TP53、TNF、EGFR等核心基因調控HIF-1信號通路、AGE-RAGE信號通路、EGFR信號通路等發揮治療效果,但更深層次的機制與作用過程仍需進一步生物學實驗進行驗證,同時應結合臨床深入探究。