基于網絡藥理學及實驗驗證探討淫羊藿苷干預強直性脊柱炎的分子機制?

徐曉涵,劉宏瀟,屈馨寧,宋俊垚

(中國中醫科學院廣安門醫院,北京 100053)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種以炎癥性腰痛、晨僵和脊柱活動受限為特征的慢性進行性自身免疫病,其基本病理改變是附著點處炎癥,通常發生在骶髂關節、脊柱關節和椎旁組織等[1],隨著病情的發展,附著點處發生廣泛鈣化,導致關節畸形、活動受限甚至殘疾[2]。同時,AS可并發關節外病變,包括眼睛、胃腸道、心血管系統、呼吸系統和神經系統的損傷,嚴重影響患者的生活質量,給家庭和社會造成巨大負擔[3-5]。目前,口服非甾體類抗炎藥、改善疾病的抗風濕藥物和生物制劑等藥物的治療目的主要是改善臨床癥狀,降低疾病活動度,能否延緩病情進展還存在爭議,并且長期應用這些藥物存在心血管、胃腸道和腎臟系統的不良反應,增加罹患感染、腫瘤的風險[6]。因此,尋求更有效的AS防治藥物是目前研究的主要領域之一。

鑒于AS復雜且尚未明確的發病機制,天然藥物的多靶向作用特點為開發新藥提供了基礎。淫羊藿具有堅筋骨而祛風濕之功效,稟性辛溫,辛以潤腎,甘溫可補陽益精,《日華子》言其“益腎壯陽,并能通行經絡”,淫羊藿可通氣行血、緩解痹痛,研究發現其有效活性成分對機體主要的免疫器官胸腺和脾臟具有重要的調節作用,通過巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞影響特異性和非特異性免疫,通過白細胞介素(interleukin, IL)-2、IL-3、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α等細胞因子發揮免疫調節作用[7],是目前治療AS常用中藥之一。淫羊藿苷(icariin, ICA)是淫羊藿中分離得到的一種黃酮類化合物,被認為是其主要活性成分[8],現代藥理學研究發現,淫羊藿苷對包括神經系統、生殖系統和骨骼系統在內的多個系統具有強大的生物學效應[9-11],可以通過調節核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, RANKL)/骨保護素(osteoprotegerin, OPG)信號通路調控成骨細胞增殖和分化,可預防軟骨退變,促進軟骨修復,調節骨代謝[12],但ICA在AS中的作用機制尚需進一步明確。

網絡藥理學是結合經典藥理學、系統生物學、計算機技術、生物信息學等學科,從分子-細胞-器官等多個層面系統研究藥物與治療靶點相互作用的綜合方法[13-14]。該方法已被廣泛應用于中藥藥理機制和安全性的研究,對研究和開發當代中藥多組分、多靶點、多通路的功能具有重要意義[15-16]。本研究通過網絡藥理學分析方法,利用多個數據庫篩選ICA的潛在藥物靶點和AS的疾病靶點,從而預測ICA治療AS的靶點和途徑,并根據這些靶點之間的拓撲相互作用確定關鍵基因。隨后通過分子對接、體外實驗驗證并確定ICA干預AS的潛在作用靶點。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學預測

1.1.1 數據庫 研究中應用的數據庫見表1。

表1 用于靶點篩選及可視化的數據庫

1.1.2 ICA相關靶點篩選 使用TCMSP數據庫確定ICA的口服生物利用度(oral bioavailability, OB)[17]和類藥性(drug-likeness, DL)[18]分別為41.58%和0.61。從PubChem數據庫中獲取ICA的2D/3D結構用于后續靶點預測,見表2。使用Pharmmapper和SwissTargetPrediction數據庫預測靶點,對兩個數據庫中的靶點進行合并、去重,將結果導入Uniprot數據庫進行蛋白質靶點標準化處理。

表2 淫羊藿苷基本信息

1.1.3 AS相關基因靶點預測 使用OMMI、DrugBank、GeneCards、Therapeutic Target Database、DisGeNET等5個數據庫進行AS基因檢索,檢索關鍵詞為“Ankylosing Spondylitis”。對結果進行合并、去重后導入 UniProt數據庫進行蛋白質靶點標準化處理。

1.1.4 ICA-AS關鍵基因及蛋白質互作(protein protein interaction, PPI)網絡構建 取ICA和AS的預測靶點交集,使用venny 2.1.0在線工具繪制維恩圖。將交集靶點導入STRING數據庫,設置類型為“Homo sapiens”,“最高置信度(0.900)”為最小交互分數,其他所有參數默認,將得到的結果導入Cytoscape 3.9.1中,生成ICA-AS的可視化PPI網絡圖。

1.1.5 ICA-AS關鍵基因的生物信息學分析 將ICA-AS關鍵基因導入metscape數據庫,進行基因本體論(gene ontology, GO)及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析,類型選擇“Homo sapiens”。使用生物信息學網絡工具(http://bioinformatic.com.cn/),對富集結果創建可視化氣泡圖。

1.2 分子對接

PDB格式的ICA結構從PubChem數據庫中獲取,關鍵靶蛋白結構從PDB數據庫中獲取,以靶蛋白為受體,ICA為配體,通過AutoDock Tools 1.5.6軟件,將蛋白質晶體結構去除水分子,插入氫原子,計算電荷,確定分子對接的活性位點[19]。使用Autodock Vina軟件對ICA-AS的關鍵靶點進行分子對接[20],對接評分用于評估ICA與主要靶點的結合親和力。使用PyMOL 2.2.0軟件實現對接結構的可視化,將蛋白渲染成條帶,更改配體顏色,設置顯示氫鍵和周圍氨基酸,從而優化對接蛋白結構。

1.3 體外實驗驗證

1.3.1 樣本來源 招募就診于廣安門醫院風濕病科門診的活動期患者15名,診斷標準參照1984年修訂的紐約標準[21],且Bath強直性脊柱炎疾病活動性指數(bath ankylosing spondylitis disease activity index, BASDAI)≥4。同時于廣安門醫院體檢中心招募性別、年齡相匹配的健康志愿者15名,見表3。本研究獲中國中醫科學院廣安門醫院倫理委員會批準(編號:2018-033-SQ)。

表3 受試者基本臨床特征(n=15)

1.3.2 實驗試劑 ICA(貨號:110737-201516),中國食品藥品檢定研究院;兔抗人RORc(貨號:SAB2102985),美國Sigma公司;兔抗人JAK2、磷酸化JAK2(phosphorylated-JAK2,p-JAK2)、磷酸化STAT3(phosphorylated-STAT3, p-STAT3),貨號:ab108596、ab12301、ab76315,英國Abcam公司;鼠抗人STAT3(貨號:ab68153),英國Abcam公司;全蛋白提取試劑盒(貨號:KGP2100),中國凱基生物科技有限公司;增強化學發光(enhanced chemi luminescence, ECL)發光液(貨號:WBKLS0500), 美國MILLIPORE公司;組織細胞RNA提取試劑盒(貨號:cw0560s),二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號:cw0014s),中國康為世紀生物科技有限公司;High-Capacity cDNA 反轉錄試劑盒(貨號:4374966),美國Applied Biosystems公司。

1.3.3 分離外周血單個核細胞 全部受試者于清晨、空腹取坐位采集肘窩靜脈血4 mL,使用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝管收集血液樣本,于4 ℃靜置存放,在2 h內完成外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的分離。將4 mL血液與等量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)混勻,取一支15 mL 無菌無酶的離心管加入4 mL恢復至室溫的人外周血淋巴細胞分離液;用1 mL移液器小心、緩慢地將血液加入離心管中。離心后吸取中間呈云霧狀的PBMC層,加入等量的PBS緩沖液,離心5 min清洗細胞3次,此時底層白色沉淀即PBMC。

1.3.4 細胞培養 將制備好的PBMC懸浮液接種于細胞密度為2×106個細胞/mL的6孔細胞培養板中(1孔為健康對照組PBMC, 4孔為活動期AS患者PBMC),每孔2 mL,在含5%二氧化碳的培養箱中37 ℃孵育24 h。24 h后,將低劑量(L組)、中劑量(M組)和高劑量(H組)的ICA分別加入3例AS患者的PBMC孔中,溶液最終濃度分別為12.5 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL,以健康對照組(Con組)和剩余活動期AS患者(AS組)的PBMC孔為空白對照組。在含5%二氧化碳的37 ℃培養箱中繼續培養24 h。將各濃度組和對照組的細胞液收集在離心管中,離心5 min收集細胞沉淀物。

1.3.5 Western blot 檢測 配制裂解緩沖液用于提取細胞全蛋白,使用BCA法測定蛋白濃度。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠電泳分離并將等量的總蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上,在37 ℃下采用5%脫脂奶粉進行膜封閉處理2 h,加入1:1 000稀釋后的一抗RORc、JAK2、pJAK2、pSTAT3、STAT3,在4 ℃下孵育過夜。取出PVDF膜用含Tween-20的Tris緩沖液(TBS with Tween-20, TBST)清洗3次,加入稀釋后的二抗在室溫下孵育2 h。將膜正面接觸配制好的ECL發光液進行顯影。

1.3.6 實時定量PCR檢測 使用超純RNA提取試劑盒提取總RNA,在1%瓊脂糖凝膠上分離,使用Applied Biosystems TM 7500快速實時PCR系統(carlsbad, CA)進行定量mRNA的表達。配置反應體系,擴增40個循環,95 ℃擴增15 s,60 ℃擴增1 min,60 ℃擴增15 s。以GAPDH作為內參基因,采用2-△△ct法定量檢測RORc mRNA的相對表達量。引物序列如下表4所示。

表4 PCR引物序列

2 結果

2.1 ICA-AS相關靶點篩選

合并和刪除SwissTarget Prediction與Pharmmapper數據庫中的重復項后,發現了364個ICA作用靶點。同時,通過OMMI、DrugBank、GeneCards、DisGeNET、Therapeutic Target Database等數據庫共檢索到AS相關靶點2 641個。使用Venny2.1.0的分析工具,共發現了109個ICA-AS交集靶點,見圖1。

圖1 淫羊藿苷(ICA)與強直性脊柱炎(AS)病理交集靶點的維恩圖

A.共69個節點161條邊的PPI網絡;B.7個節點14條邊的核心網絡

A.分子功能;B.生物過程;C.細胞組成注:僅列出按P值(P<0.01)排序的前20個條目及相應的計數值;氣泡的大小表示該條目上富集的目標數量,顏色表示P值

2.2 PPI互作網絡分析

PPI分析表明,網絡內部有161條連線和69個節點,見圖2A。節點的大小和色調由自由度(degree)值決定。節點網絡越密集,色調越暗,表示目標越重要。其中MAPK1、HSP90AA1、EGFR、RELA、JAK2、ESR1、MAPK14是網絡中最重要的靶點,見表5,利用這些靶點構建一個新的網絡,如圖2B所示。

表5 ICA治療AS的關鍵靶點拓撲信息分析

2.3 潛在靶點的GO及KEGG功能注釋分析

GO富集分析包括生物過程、細胞成分和分子功能3個分項。這109個ICA-AS關鍵靶點涉及1 286個生物過程、67個細胞成分和125個分子功能。分別取前20個結果形成可視化氣泡圖,見圖3。結果顯示,最顯著的生物學過程包括omega-羥化酶P450途徑、正調控血小板活化、白細胞聚集、負調控急性炎癥反應、STAT蛋白酪氨酸磷酸化等。最重要的細胞成分主要包括富含纖維蛋白-1的顆粒、管腔和內溶酶體。在分子功能方面,其最重要的分子功能包括腺嘌呤核苷三磷酸(a denosine triphosphate, ATP)依賴性蛋白解聚酶活性和C3HC4型環指結構域結合等。此外,還發現了164條富集的KEGG通路,按P-value 值從小到大排列,取前 20 條通路制作富集氣泡圖,見圖4,這些通路主要涉及前列腺癌、IL-17信號通路、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)信號通路等。

注:僅列出按P值(P<0.01)排序的前20個條目及相應的計數值;氣泡的大小表示該條目上富集的目標數量,顏色表示P值

2.4 ICA-AS關鍵基因-通路網絡分析

在164條KEGG富集通路中,富集指數平均值為16.998,取富集指數>16.988的前66條通路作進一步分析,發現其中共包含72個活性靶點。對該通路-靶點網絡作進一步分析并使用Cytoscape 3.9.1作出藥物-疾病-通路-靶點網絡圖,見圖5。節點面積大小代表Degree值,面積越大,則表示該節點在網絡中影響力越大。節點之間的連線表示ICA可能作用于AS的靶點與通路之間的關系,連線越緊密表示該靶點越有可能是藥物干預疾病的有效靶點。由圖可知在此網絡中最重要的網絡調控靶點是MAPK1、RELA、NFKB1、MAPK14、TNF、PRKCB等。

注:藍色長方形文本框代表核心靶點,紅色方形文本框表示富集通路,節點的面積表示Degree值的大小

2.5 分子對接驗證

用最低結合能來表示來評價ICA與靶蛋白結合能力,當結合能<-4.25 kcal/mol時,可認為二者存在結合活性,結合能<-5.0 kcal/mol表明結合活性好[22],結合能<-7.0 kcal/mol表明結合活性高[23-24]。如表6所示,計算結果表明,20個基因中有18個滿足親和性<-7 kcal/mol的標準,結合模式見圖6。分子對接數據的一致性進一步強調了網絡藥理學預測主要靶點的可靠性。

注:淫羊藿苷(ICA)是藍色的棒狀模型,蛋白質分子是紫色的模型,連接的氫鍵用黃色虛線表示,藍色和紅色的氣泡表示金屬離子

表6 淫羊藿苷與核心靶分子對接最低結合能

2.6 不同濃度ICA對AS-PBMC中JAK2/STAT3通路相關蛋白的影響

如圖7所示,各組間比較,JAK2和STAT3水平差異均無統計學意義,與健康對照組比較,活動期AS患者pJAK2和pSTAT3水平明顯升高(P<0.05),經ICA干預后,pJAK2和pSTAT3水平顯著降低(P<0.05),提示隨著ICA濃度的增加,ICA對JAK2和STAT3的磷酸化水平具有顯著抑制作用。

注:與Con組比較*P<0.05;與AS-A組比較#P<0.05;Con.健康對照組;AS-A.活動期AS組;L.ICA低劑量組;M.ICA中劑量組;H.ICA高劑量組;信號轉導與轉錄激活子3(STAT3),磷酸化STAT3(pSTAT3),蛋白酪氨酸激酶2(JAK2),磷酸化JAK2(pJAK2)

2.7 不同濃度ICA對AS-PBMC中RORγt蛋白及RORc mRNA的影響

與健康對照組比較,活動期AS患者的PBMC中特異性轉錄因子RORc γt蛋白和RORc mRNA表達量顯著增加(P<0.05),見圖8。經ICA干預后,可以下調RORγt蛋白和RORc mRNA的表達(P<0.05)。

與Con組比較*P<0.05;與AS-A組比較#P<0.05;注:Con.健康對照組;AS-A.活動期AS組;L.ICA低劑量組;M.ICA中劑量組;H.ICA高劑量組;維甲酸相關孤兒核受體蛋白γt(RORγt),RORγt編碼基因(RORc)

3 討論

中醫古籍中并無關于AS的病名記載,根據其臨床表現一般將AS歸屬于“大僂”“脊痹”“腎痹”等病。正如《素問·脈要精微論篇》中形容“腰者,腎之府,轉搖不能,腎將憊矣”。與AS下腰背部疼痛、晨僵、活動受限的臨床表現極為相似,并指出AS病位在腎。腎為先天之本,藏精主骨生髓,腎中所藏之精為來自父母生殖之精的遺傳物質,作為行使一切生命活動的基本物質,調控著其他臟腑的陰陽盛衰,具有與DNA相似的遺傳特性。AS作為一種具有高度遺傳特征的自身免疫病,先天攜帶的易感基因如人白細胞抗原 (human leukocyte antigen, HLA) B27、TNF-α等,在發病中起到了重要作用[25],而先天稟賦不足、腎精虧虛者由于生命遺傳信息的異常傳遞易導致本病發生,因此腎藏象功能失常是AS發病的重要因素之一。30歲左右的青壯年男性本應筋強骨壯,肌肉隆盛,本病反而好發于這類人群,表明先天不足、后天調護不當損傷腎中精氣是AS發病之本,治療上多以補腎壯督為基本治法[26],淫羊藿作為補腎陽、強筋骨、祛風濕之要藥,臨床多用于AS的治療中。

在目前針對骨質疏松和骨關節病的治療中,研究發現淫羊藿苷不僅能促進軟骨分化和成骨細胞的形成,并通過控制OPG與RANKL的表達比例,抑制破骨細胞的產生,從而達到減少骨質流失、促進軟骨修復的作用[12]。然而,與類風濕關節炎、骨關節病不同的是,AS是一種以炎癥、骨破壞和新骨形成為特征的自身免疫性疾病,在關節發生骨破壞的同時伴有異位成骨的現象,淫羊藿苷對于抑制AS炎癥及異位骨化的作用機制尚不明確。臨床研究已證明以淫羊藿為主要藥物的中醫藥治療AS方案具有較好的臨床優勢,進一步探索中藥單體淫羊藿苷干預AS的機制對于新藥開發具有重要意義。本研究采用網絡藥理學分析預測ICA治療AS的潛在靶點,從多個數據庫中獲得了109個ICA 抗AS的潛在靶點基因,其中MAPK1、HSP90AA1、EGFR、RELA、JAK2、ESR1、MAPK14、PRKCD、TNF、PPARA、IGF1、PRKCB、F2、AR、HSPA1A、IL2、NFKB1、JAK3、NOS2、PDPK1可能是ICA調控AS的核心基因。核心靶點的GO和KEGG富集分析表明,這些基因可能參與了AS炎癥的發生,ICA可能通過多靶點和途徑調節AS的生物學過程。分子對接進一步確定了ICA與RELA、NOS2、MAPK14、MAPK1、IGF1、HSPA1A、HSP90AA1、JAK2、PRKCB等基因的結合能<-8 kcal/mol,證實了ICA與這些靶因子具有高結合潛力。

RELA屬于轉錄因子核因子 (nuclear factor,NF) -κB家族復合體,在炎癥和免疫反應中起著至關重要的作用。除了骶髂關節或脊柱損傷外,AS患者還經常報告肺功能受損,這與NF-κB信號通路、氧化標記物和炎癥因子有關[27]。促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路對于炎癥細胞的激活至關重要,炎癥細胞的激活是由絲裂原活化蛋白激酶激酶 (mitogen-activated protein kinase kinases, MKKs)、絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)和MAPK的連續磷酸化觸發的[28]。在哺乳動物細胞中,有3種不同的MAPK通路,包括p38 MAPK (MAPK14)通路,在本研究發現的ICA-AS前9個關鍵基因中,MAPK1和MAPK14等與MAPK通路密切相關。胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor , IGF)-1也在AS的發病中發揮了重要作用,成骨細胞在骨吸收過程中產生IGF-1并促進新骨形成[29],IGF-1與成骨細胞表面受體結合,刺激膠原合成,抑制破骨細胞膠原酶的產生,IGF-1使成骨細胞和骨基質酸化,從而促進骨礦化[30],同時IGF-1還抑制成骨細胞凋亡[31],進而調控了骨吸收和骨生長之間的平衡。熱休克蛋白(heat shock protein, HSP) 90家族是一種高度保守的分子伴侶[32],由HSP90、HSP90、葡萄糖調節蛋白 (gloucose requlated protein , GRP) 94和腫瘤壞死因子受體相關蛋白(TNF receptor-associated protein , TRAP) 1亞型組成。它參與多種生物過程,包括病毒感染、免疫控制和信號轉導[33]。HSP90是增強JAK和kappa B 抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase, IKK)活性所必需的,這促進了STAT和NF-κB的激活和核易位,以發揮其在炎癥發生中的作用[34]。

炎癥是AS發生發展的初始和重要環節,炎癥可誘導脊柱和骶髂關節發生骨破壞和新骨形成[35]。Harrington等人發現輔助性T細胞(T helper cell , Th) 17在AS的發病中發揮了重要作用,其分泌的IL-17是一種參與宿主防御并誘導中性粒細胞誘導和成熟的細胞因子[36]。IL-17的分泌是由JAK2/STAT3信號通路介導的[37]。JAK2和STAT3是JAK2/STAT3信號通路中的兩個重要因子,其中STAT3不僅直接介導IL-17的分泌,還能促進人類Th17細胞特異性轉錄因子RORγt的表達,對Th17的分化具有重要意義[38]。有研究表明,在類風濕關節炎小鼠模型中,ICA可抑制STAT3激活介導的Th17細胞分泌IL-17細胞因子,抑制炎癥和關節破壞[39],但尚無針對ICA抗AS炎癥的相關研究,因此,影響IL-17分泌的重要途徑JAK2/STAT3信號通路可能為探索ICA干預AS分子機制的切入點。JAK2和STAT3是該通路的關鍵因子,STAT3蛋白通過JAK2/STAT3信號通路被磷酸化[40],進而結合IL-17啟動子區,促進IL-17分泌。同時,Th17分化關鍵轉錄因子RORc也受到STAT3的顯著影響,STAT3可直接結合RORc啟動子區域,促進Th17分化,間接促進IL-17的分泌[41-42]。STAT3的功能通過JAK2的磷酸化激活,磷酸化的JAK2可以磷酸化IL-23R的酪氨酸結合位點,從而形成STAT3的結合區,磷酸化的STAT3與結合區分離后,同源的STAT3被二聚化并轉移到細胞核中發揮功能[43]。本研究結果表明,活動期AS患者的PBMCs具有較高的JAK2和STAT3磷酸化水平。經不同濃度ICA干預后,JAK2和STAT3的磷酸化水平及RORc mRNA表達均顯著降低,且隨著ICA劑量的增加,其對JAK2和STAT3磷酸化水平的抑制作用更為明顯,表明ICA可能通過對JAK2/STAT3信號通路的抑制從而抑制轉錄因子RORγt對Th17分化的影響,發揮了抗AS炎癥的作用。

綜上,結合網絡藥理學、分子對接和體外實驗,本研究發現ICA可通過RELA、NOS2、MAPK14、MAPK1、IGF1、HSPA1A、HSP90AA1、JAK2等關鍵靶點和JAK2/STAT3等IL17關鍵信號通路抑制AS炎癥,其作用可能是通過核心靶點和通路的多重協同作用實現的。