葛根菊苣茯苓方對高尿酸血癥大鼠的作用與機(jī)制研究?

宋紀(jì)顯,陳 琦,陳 捷,郭亞凈,武雙平,吉恩生,2

(1.河北中醫(yī)藥大學(xué),石家莊 050200;2.河北省中醫(yī)藥結(jié)合氫醫(yī)學(xué)技術(shù)創(chuàng)新中心,石家莊 050091;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬平安醫(yī)院,石家莊 050000)

高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)是一種代謝性疾病,通常由嘌呤代謝異常引起,以尿酸生成增多及排泄減少為主要特征,以血尿酸異常升高為主要表現(xiàn)[1],是痛風(fēng)發(fā)生的直接因素,還會導(dǎo)致尿酸性腎結(jié)石、腎功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥[2-3]。人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,使HUA的患病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[4]。由于HUA早期無明顯癥狀,而西藥治療又因常見的不良反應(yīng)導(dǎo)致長期用藥受限。因此,尋找安全有效的中醫(yī)藥治療方法對防治和延緩HUA并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。

HUA發(fā)作前癥狀多不明顯,中醫(yī)理論認(rèn)為其屬于“未病”或“伏邪”范疇[5]。本病病機(jī)總屬虛實(shí)夾雜,多由“濕”邪引起,以脾腎不足為本,濕、熱、痰瘀互結(jié)為標(biāo),病位在于筋骨,源于脾腎,故補(bǔ)腎健脾、利濕祛濁是其主要治則[6-8]。中醫(yī)藥治療高尿酸血癥的案例較多,多以清熱利濕、除濕通絡(luò)、益氣健脾、泄?jié)犰铕龅葹榛局蝿t[9-10]。葛根菊苣茯苓方取《太平惠民和劑局方》所載參苓白術(shù)散健脾滲濕之義化裁而成,具有補(bǔ)腎健脾、清熱利濕、化痰祛瘀之功效,方中山藥健脾養(yǎng)胃、滋腎益精,葛根解肌退熱、升陽止瀉,共為君藥;茯苓健脾利水,薏苡仁健脾滲濕,山楂行氣散瘀、化濁降脂,陳皮健脾燥濕,共為臣藥;菊苣、梔子、蒲公英清熱利尿,百合養(yǎng)陰潤肺,桑葉疏風(fēng)清熱,共為佐藥;干姜溫中散寒、緩和其他藥物寒性,甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥,共為使藥,諸藥配伍,共奏健脾補(bǔ)腎、清熱利濕、化痰祛瘀之效[11-12]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)方中菊苣正丁醇提取物、葛根提取物葛根異黃酮具有促進(jìn)尿酸排泄的作用[13-14],菊苣、葛根、桑葉配方使用可以降低高尿酸合并關(guān)節(jié)炎小鼠的尿酸水平[15],茯苓、山藥均可不同程度降低HUA大鼠尿酸水平[16-17]。本實(shí)驗(yàn)建立HUA大鼠模型,同時以別嘌醇為陽性對照藥,研究不同劑量葛根菊苣茯苓方對高尿酸血癥大鼠尿酸水平的影響及其可能的作用機(jī)制,為葛根菊苣茯苓方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究經(jīng)河北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn),編號:DWLL202304004。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠42只,8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購自北京維通利華動物有限公司,動物許可證號:SCXK[京]2016-0 006。大鼠飼養(yǎng)于河北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,可自由進(jìn)食、飲水,動物房室內(nèi)保持相對穩(wěn)定的溫度和濕度。

1.2 主要藥物與制備

葛根菊苣茯苓方由葛根、菊苣、茯苓、薏苡仁、山藥、桑葉、梔子、蒲公英、百合、山楂、陳皮、干姜、甘草組成,以上藥物由河北中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂提供,經(jīng)河北中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定均為正品。將上述中藥飲片加入400 mL飲用水浸泡30 min,之后煎煮40 min,留取藥液;第2次加水300 mL煎煮30 min,留取藥液,將2次煎煮所得藥液充分混合后過濾,按低、中、高劑量濃縮制備成含生藥0.615 g、1.23 g、2.46 g的水煎液。氧嗪酸鉀(貨號:P831461,規(guī)格:100 g/瓶)、腺嘌呤(貨號:A800685,規(guī)格:25 g/瓶),上海麥克林生化科技股份有限公司;別嘌醇(貨號:S45825,規(guī)格:25 g/瓶),上海源葉生物科技有限公司。

1.3 主要試劑

蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(貨號:G1120),北京索萊寶科技有限公司;血尿酸(serum uric acid,SUA)ELISA測定試劑盒(貨號:GM1111)、血肌酐(serum creatinine,SCr)ELISA測定試劑盒(貨號:GM1112)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)ELISA測定試劑盒(貨號:GM1110)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)ELISA測定試劑盒(貨號:GM1102)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)ELISA測定試劑盒(貨號:GM1103)、GAPDH抗體(貨號:GB15002),武漢賽維爾生物有限公司;腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)ELISA檢測試劑盒(貨號:A048-2-1)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)ELISA檢測試劑盒(貨號:A002-1-1),南京建成生物工程研究所;有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(organic anion,OAT)3抗體(貨號:bs-0609R)、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette sub-family G member,ABCG)2抗體(貨號:bs-4780R),北京博奧森生物技術(shù)有限公司;尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(recombinant urate transporter,URAT)1抗體(貨號:GB111847)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1抗體(貨號:GB113690)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter type,GLUT)9抗體(貨號:26486-1-AP),武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

DM5000B型光學(xué)顯微鏡,德國Leica公司;Vilber Fusion FX5 Spectra型多功能成像系統(tǒng),法國VilberLourmat公司;Varioskan LUX型多功能讀數(shù)儀、 EPOCH 3020型全自動酶標(biāo)儀,美國Thermo Scientific公司。

2 方法

2.1 分組與造模

將42只清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組(n=6):正常組、模型組、葛根菊苣茯苓方低劑量組(6.15 g/kg)、中劑量組(12.3 g/kg)、高劑量組(24.6 g/kg)、別嘌醇組(0.03 g/kg)、正常給藥組(葛根菊苣茯苓方中劑量)。以上劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》進(jìn)行換算[18],相當(dāng)于體質(zhì)量為70 kg的成人每日用量的等效劑量。本實(shí)驗(yàn)造模過程及方法參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[19],除正常組及正常給藥組外,其余各組大鼠每日灌胃氧嗪酸鉀1.5 g/kg、腺嘌呤0.1 g/kg建立HUA模型,連續(xù)21 d。從第8天開始,除正常組與模型組外,其余各組大鼠每日灌胃葛根菊苣茯苓方及別嘌醇干預(yù)治療,持續(xù)14 d,正常組與模型組給予等量蒸餾水。

2.2 樣本采集

末次給藥24 h后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠,股動脈取血,離心后取血清于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩４笫笱雠P位固定于手術(shù)操作板上,充分暴露腹腔,摘取腎臟、肝臟后用0.9%氯化鈉溶液沖洗,腎臟拍照、稱取質(zhì)量。將部分腎臟組織取出并置于凍存管內(nèi),-80 ℃保存,用于Western blot檢測;用4%多聚甲醛固定部分腎臟、肝臟組織,制備石蠟切片。

2.3 計算腎臟系數(shù)

統(tǒng)計各組大鼠體質(zhì)量及腎臟質(zhì)量,并計算腎臟系數(shù)(腎臟系數(shù)=腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量)。

2.4 蘇木精-伊紅hematoxylin-eosin staining,HE染色觀察腎臟、肝臟組織形態(tài)

取固定包埋的腎臟、肝臟組織制作石蠟切片(厚度3～4 μm),行HE染色,在顯微鏡下觀察、采集圖像。

2.5 ELISA檢測

取凍存的大鼠血清,室溫下溶解,參照ELISA試劑盒說明書,利用酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清中SUA、BUN、SCr、XOD、ADA、ALT、AST含量。

2.6 Western blot檢測

腎臟組織剪碎后加入裂解液,離心后取上清液,二奎琳甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度。蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入OAT1(1:1 000)、OAT3(1:1 000)、ABCG2(1:1 000)、URAT1(1:1 000)、GLUT9(1:1 000)、GAPDH(1:5 000)一抗4 ℃孵育12 h,再加入對應(yīng)的二抗(1:10 000)常溫孵育,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影,Image J定量分析,以目的條帶/GAPDH灰度值作為目的蛋白的相對表達(dá)量,用GraphPad Prism 8.0繪制統(tǒng)計圖。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠腎臟外觀及腎臟系數(shù)的影響

正常組大鼠腎臟形態(tài)大小均正常,且色澤暗紅,表面光滑,模型組大鼠腎臟變大,色澤變淺且表面皺縮而有顆粒感,見圖1。模型組大鼠體質(zhì)量與正常組比較明顯下降(P<0.05),腎臟質(zhì)量明顯增加(P<0.05),腎臟系數(shù)顯著增大(P<0.05);與模型組比較葛根菊苣茯苓方中劑量組與別嘌醇組大鼠腎臟質(zhì)量明顯降低(P<0.05),腎臟系數(shù)明顯減小(P<0.05),見表1。

A.正常組;B.模型組;C.葛根菊苣茯苓方低劑量組;D.葛根菊苣茯苓方中劑量組;E.葛根菊苣茯苓方高劑量組;F.別嘌醇組;G.正常給藥組

A.正常組;B.模型組;C.葛根菊苣茯苓方低劑量組;D.葛根菊苣茯苓方中劑量組;E.葛根菊苣茯苓方高劑量組;F.別嘌醇組;G.正常給藥組

注:有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(OAT1),有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體3(OAT3),尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(URAT1),三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(ABCG2),葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(GLUT9)A.正常組;B.模型組;C.葛根菊苣茯苓方低劑量組;D.葛根菊苣茯苓方中劑量組;E.葛根菊苣茯苓方高劑量組;F.別嘌醇組;G.正常給藥組

A.正常組;B.模型組;C.葛根菊苣茯苓方低劑量組;D.葛根菊苣茯苓方中劑量組;E.葛根菊苣茯苓方高劑量組;F.別嘌醇組;G.正常給藥組

表1 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量及腎臟系數(shù)的影響

3.2 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠血清中BUN、SUA、SCr、XOD、ADA水平的影響 ELISA結(jié)果顯示模型組大鼠血清SUA、BUN、SCr、XOD、ADA含量與正常組比較明顯升高(P<0.05),與模型組比較葛根菊苣茯苓方和別嘌醇組大鼠上述指標(biāo)表達(dá)水平均有不同程度下降(P<0.05)。見表2。

表2 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠血清BUN、SUA、SCr、XOD、ADA的影響

3.3 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠腎臟組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示正常組大鼠腎小球、腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,未見明顯尿酸鹽結(jié)晶與炎性細(xì)胞浸潤;模型組大鼠腎小球部分萎縮,腎小管代償性擴(kuò)張,管內(nèi)可見大小不等的空泡、炎性細(xì)胞浸潤以及尿酸鹽結(jié)晶。與模型組比較葛根菊苣茯苓方和別嘌醇組大鼠腎小球、腎小管病理改變均有不同程度改善。見圖2。

3.4 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠腎臟OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠腎臟組織OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05);與模型組比較,葛根菊苣茯苓方和別嘌醇組大鼠腎臟組織OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表達(dá)水平有不同程度上升,URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度下降(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠腎臟組織中OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)的影響

3.5 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠肝臟組織形態(tài)及ALT、AST水平的影響

HE染色結(jié)果顯示各組大鼠肝臟組織形態(tài)基本正常,肝細(xì)胞索排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)大致清晰。血清ELISA結(jié)果顯示各組大鼠間ALT、AST水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4、表4。

表4 葛根菊苣茯苓方對HUA大鼠肝臟ALT、AST水平的影響

4 討論

HUA是由嘌呤代謝障礙引起,以尿酸生成、排泄失衡為特征的代謝性疾病[20]。隨著HUA發(fā)病率的逐年上升[21],尋找安全有效的中醫(yī)藥治療方法十分必要。為此,本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合使用氧嗪酸鉀和腺嘌呤建立HUA模型以模擬高尿酸血癥,同時給予不同劑量葛根菊苣茯苓方干預(yù),探究中醫(yī)藥治療的效果及潛在機(jī)制。氧嗪酸鉀可降低尿酸酶活性,腺嘌呤作為尿酸前體物質(zhì)可促進(jìn)尿酸合成,二者合用可升高尿酸[22-23]。別嘌醇可減弱黃嘌呤氧化酶的活性,抑制尿酸生成,故選用別嘌醇為陽性對照藥作為療效參考[24],另外單獨(dú)設(shè)立葛根菊苣茯苓方組以觀察此方對肝腎功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),模型組大鼠SUA、BUN、SCr水平與正常組比較明顯升高,同時腎臟系數(shù)增加,腎臟呈灰白色且有顆粒感,腎小管出現(xiàn)不同程度擴(kuò)張,說明模型制備成功。

HUA可導(dǎo)致機(jī)體SUA、SCr、BUN水平升高,SCr是由磷酸肌酸代謝生成的化合物,BUN是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物,二者含量增高說明腎臟濾過功能受損[25],大量過飽和尿酸會在血液中形成結(jié)晶并沉積于腎小球、腎小管及腎間質(zhì),導(dǎo)致腎臟損傷[26]。ADA可催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤,核酸代謝酶XOD可與體內(nèi)黃嘌呤和次黃嘌呤發(fā)生氧化反應(yīng)并生成尿酸[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),模型組大鼠腎臟系數(shù)與正常組比較明顯升高,XOD、ADA水平升高;同時模型組大鼠腎小球部分萎縮硬化,出現(xiàn)尿酸鹽結(jié)晶以及腎小管代償性擴(kuò)張。給予葛根菊苣茯苓方及別嘌醇治療后,大鼠腎臟系數(shù)顯著下降,腎臟病理損傷得到改善,SUA、BUN、SCr、XOD、ADA水平也出現(xiàn)不同程度下降,這說明葛根菊苣茯苓方可降低大鼠高尿酸水平,改善腎臟病理損傷。同時肝臟HE染色及ALT、AST結(jié)果顯示各給藥組肝臟均無異常病理變化,肝功能基本正常,說明葛根菊苣茯苓方?jīng)]有明顯的不良反應(yīng)。

尿酸在腎臟中的代謝主要由尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控,包括OAT1、OAT3、ABCG2、URAT1、GLUT9等均發(fā)揮重要作用。OAT1和OAT3主要分布在腎臟近曲小管基底膜側(cè),可通過介導(dǎo)有機(jī)陰離子化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)加速尿酸排泄[28]。ABCG2是腺苷三磷酸結(jié)合“半轉(zhuǎn)運(yùn)體”蛋白,可促進(jìn)腸道尿酸排泄[29]。URAT1可促進(jìn)尿酸與腎小管上皮細(xì)胞中的陰離子交換;GLUT9可通過轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖促進(jìn)尿酸重吸收,二者表達(dá)上調(diào)可造成機(jī)體尿酸水平升高[30-31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表達(dá)水平明顯降低,URAT1、GLUT9蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。而與模型組比較,給予葛根菊苣茯苓方后,OAT1、OAT3、ABCG2蛋白水平上升,URAT1、GLUT9蛋白水平下降,這說明葛根菊苣茯苓方可通過調(diào)控尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)尿酸作用。

綜上所述,葛根菊苣茯苓方可通過調(diào)節(jié)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白干預(yù)大鼠體內(nèi)尿酸的生成和排泄,發(fā)揮降尿酸作用,同時對肝腎功能沒有明顯不良反應(yīng)。這為中藥復(fù)方治療HUA提供了實(shí)驗(yàn)參考和依據(jù)。